mardi 15 décembre 2020

Implication israélienne dans la création du COVID-19 à l'Université de Caroline du Nord (censuré / supprimé)

Mise à jour :  Veterans Today suit les statistiques COVID et la désinformation / censure depuis le premier jour. Maintenant, à la lumière de l'attaque de Beyrouth (Trump nous soutient), nous considérons maintenant la sortie d'une version hybridée de COVID 19 sur la zone métropolitaine de New York comme une attaque terroriste.
Les statistiques sur les hospitalisations et les décès ont été modifiées / censurées, ce qui prouve qu'il s'agissait d'une attaque biologique. Les taux de mortalité étaient plusieurs fois plus élevés qu'ailleurs et ciblaient même spécifiquement la population juive, ce qu'Israël a déjà fait par le passé.

Nous avons observé la manipulation d'Internet par Google Corporation, nous les avons suivis et avons trouvé des preuves claires et absolues qui relient ceux qui ont exécuté l'attaque de Beyrouth à ceux qui ont lancé le virus COVID 19 aux États-Unis et dans le monde.

Nous avons également regardé des vidéos de Beyrouth censurées sur Facebook, Google / YouTube et Twitter qui se sont coordonnés avec MSM (Main Stream Média ; les Grands Médias Menteurs) pour vendre un faux récit impliquant un engrais non explosible ; alors que les preuves d'une attaque massive non seulement d'Israël, mais aussi d'un brillant ensemble de drones, d'avions et même un missile.

Qui sait, une bombe nucléaire aurait pu y être chargée facilement par un camion et personne ne le remarquerait.

Maintenant que Beyrouth est en ruine, que les EAU (et le Maroc) rejoignent le Grand Israël et que la monstruosité de Qanon vend un État policier à une populace crédule, l'inexplicable devient clair.

Ci-dessous, nous prouvons la création de COVID, un projet de la CIA réalisé à travers un programme de couverture dans une université privée utilisant des experts en armes biologiques. La cible? Piller l'économie américaine, amener l'Amérique à la guerre civile et permettre au pouvoir de se centraliser sous le contrôle de Kosher Nostra sans subterfuge, désormais inutile.

Cet article contient des preuves tangibles qui ne peuvent être ni contestées ni déniées, que vous pouvez soumettre à toute agence gouvernementale ou à des professionnels de la santé.

Ce qui n'est pas encore prouvé, mais qui vient à l'esprit, c'est que le programme américain d'armes biologiques à Fort Detrick, Maryland, l'équipement et certainement le personnel clé, ont certainement migré vers les laboratoires secrets des grandes universités d'État afin de «se cacher à la vue de tous».

Suivez les carrières, tous les liens sont inclus, de ceux qui ont travaillé sur le projet Wuhan-COVID en 2017.

De plus, notez que le même personnel et le même équipement sont utilisés pour de fausses recherches et tests de «prévention» que pour la militarisation et la production réelle.

Depuis la rédaction de cet article, nous avons commencé à examiner les opérations mondiales de l'entrepreneur nucléaire / bio / chimie américain, le favori de Kushner-Trump, Battelle, et leurs laboratoires secrets à travers le monde.

Quand nous avons commencé, notre personnel a commencé à être menacé. C'était une grave erreur.

Soumettez ce document à tout médecin ou à tout autre spécialiste qualifié en bio-sciences. Voyez ce qu'ils disent.


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introduction

Les documents ci-dessous montreront que la recherche pour créer COVID 19 a commencé aux États-Unis en 2006 et a abouti à une arme biologique réussie en 2015, avec des travaux effectués à l'Université de Caroline du Nord et à Harvard et au laboratoire de la Food and Drug Administration en Arkansas. .

Leur travail était intitulé:
Un groupe de coronavirus de chauve-souris en circulation de type SRAS montre un potentiel d'émergence humaine

Ils ont fait cela et bien plus encore, comme vous le lirez ci-dessous.

Comme Trump l'a dit, à maintes reprises, les Chinois étaient impliqués.

Le laboratoire clé des agents pathogènes spéciaux et de la biosécurité, Institut de virologie de Wuhan, Académie chinoise des sciences, Wuhan, Chine a fourni le virus de la chauve-souris de Wuhan qui a été utilisé dans l'étude américaine. Leur nom a été mentionné uniquement pour cette raison.

COVID 19 était un projet d'armes biologiques de l'armée américaine visant à fabriquer une maladie causant une pneumonie pour laquelle il serait presque impossible de vacciner les patients de plus de 40 ans.

La preuve est là, lisez simplement ce qui suit. L'étude a été menée par l'Université de Caroline du Nord et financée par l'USAID / CIA. Ils ont choisi un virus de la chauve-souris chinoise et ont également choisi d'inclure un établissement médical de Wuhan.

Maintenant, nous savons pourquoi, l’écran de fumée a été lancé par Trump pour blâmer la Chine, laquelle n'avait que peu ou rien à voir. Ce quelque chose de sataniquement mauvais est purement américain.

En novembre 2015, une étude a été publiée décrivant la capacité de produire le virus auquel nous sommes confrontés actuellement. Parmi les nombreuses personnes impliquées, il y avait UN laboratoire à Wuhan, en Chine. Il a été répertorié dès le début comme l'un des DIZAINES de labos, principalement américains, travaillant sur ce projet.

Cependant, un participant clé a été laissé de côté, l'USAID. On soupçonne, profondément, que l'USAID est une façade pour la recherche américaine sur la guerre biologique telle que celle menée à Tbilissi, en Géorgie, et ailleurs, très documentée. C'est la citation qui ajoute l'USAID au groupe de financement de la recherche.


Historique des changements

20 novembre 2015

Dans la version de cet article initialement publiée en ligne, les auteurs ont omis de mentionner une source de financement, le financement USAID-EPT-PREDICT d'EcoHealth Alliance, à Z.-LS L'erreur a été corrigée pour les versions imprimée, PDF et HTML de cet article .

[Note de l'éditeur: Nous allons maintenant présenter l'article biaisé de Pravda et, ci-dessous, l'étude réelle prouvant la capacité de produire COVID 19, prouvant que ce n'est pas un virus naturel une fois pour toutes.
Quant à savoir qui a fait quoi, ce n'est pas notre travail mais nous prouvons, catégoriquement, que lorsqu'un laboratoire chinois est mentionné, c'est un acteur mineur dans un effort américain, comme décrit de manière exhaustive ci-dessous.
Cela rend le laboratoire de Wuhan possiblement complice de la guerre biologique.
De même, lorsque
Forbes Magazine et d'autres ont déclaré qu'ils pouvaient prouver que COVID 19 avait été fabriqué naturellement et qu'ils avaient bien sûr le même accès que nous, nous soupçonnons qu'ils font partie d'un effort de désinformation lié à l'USAID et à la bio-guerre.
La suspicion n'est pas une preuve. La preuve est la preuve et il y a suffisamment de preuves ici pour s’en convaincre. Nos remerciements aux professionnels de la santé américains qui se sont vendus à l'armée américaine et à la CIA et qui ont aidés à nous amener là où nous sommes maintenant, une nation brisée en mille morceau. VeteransToday]

Pravda.Ru: Ce matériel est apparu en 2015 sur le site de la revue scientifique Natura en 2015. Ensuite, les auteurs ont affirmé qu'après l'avènement du virus du SRAS (2002-2003) et du syndrome respiratoire du Moyen-Orient (MERS), les scientifiques étaient au courant du risque de transmission interspécifique qui conduirait à une épidémie parmi les personnes.

Expérience de laboratoire réussie

Entre autres, l'équipe de recherche a étudié les chauves-souris, qui sont les plus grands incubateurs de coronavirus. Néanmoins, les chauves-souris ne pouvaient pas transmettre le coronavirus aux humains car elles ne pouvaient pas interagir avec les cellules humaines avec les récepteurs ACE2.

Le matériel a également montré que les "chauves-souris fer à cheval" sont porteuses d'une souche de coronavirus du SRAS qui peut être transmise aux humains. Elle a été nommée virus SHC014-CoV.

Pour mieux étudier ce virus, les scientifiques ont copié le coronavirus et l'ont infecté avec des souris de laboratoire. Les résultats ont montré que le virus est vraiment capable de se lier aux cellules humaines avec des récepteurs ACE2 et de se multiplier dans les cellules du système respiratoire.

Dans les travaux de recherche, il est à noter que le matériel de laboratoire, les échantillons et l'équipement qui ont été utilisés dans la recherche ont été obtenus auprès de l'Institut de recherche médicale de l'armée sur les maladies infectieuses. Cependant, il n’est pas encore possible de dire avec certitude que le virus qui a été testé sur des souris de laboratoire est le même que le coronavirus SARS-Cove-2.

Politique de l'OTAN

Cependant, des choses intéressantes peuvent être trouvées dans les documents précédents. 

Par exemple:

  • Le rapport d'activité 2019 de l'Alliance indique qu'en 2019, la première place de l'Alliance dans la recherche et le développement était occupée par le thème de la protection radiochimique et biologique (29%), supplantant le problème apparemment le plus pressant de l'Europe - le contre-terrorisme (il s'est avéré être une priorité de 4 m).
  • Un an plus tôt, en 2018, la situation était exactement le contraire: le terrorisme, comme il se doit, était en premier lieu (28%), et la protection radiochimique et biologique en quatrième (13%).

Comme l'écrit le mouchard de Bruxelles dans la chaîne de télégramme,  «étant donné l'absence de raisons visibles d'un changement aussi brutal des intérêts scientifiques, il existe deux options et les deux sont désagréables:

  • ou l'OTAN remue maintenant le cinquième point, falsifiant les données pour montrer «et nous nous sommes toujours préparés aux virus, nous sommes modernes»,
  • ou même en 2019 dans l'alliance, Dieu me pardonne, ils savaient d'où viendrait le problème.

Oui, la première option est beaucoup plus réelle, mais, voyez-vous, les faits sont surprenants.

Source:  Pravda


 

Recherche originale de 2015 non éditée et terminée

Publié: Un groupe de coronavirus de chauve-souris en circulation de type SRAS montre un potentiel d'émergence humaine par Vineet D Menachery, Boyd L Yount Jr, Kari Debbink, Sudhakar Agnihothram, Lisa E Gralinski, Jessica A Plante, Rachel L Graham, Trevor Scobey, Xing-Yi Ge, Eric F Donaldson, Scott H Randell, Antonio Lanzavecchia, Wayne A Marasco, Zhengli-Li Shi, Ralph S Baric

Un  rectificatif  à cet article a été publié le 6 avril 2016

Cet article a été mis à jour

Abstrait

L'émergence du coronavirus du syndrome respiratoire aigu sévère (SRAS-CoV) et du syndrome respiratoire du Moyen-Orient (MERS) -CoV souligne la menace d'événements de transmission inter-espèces conduisant à des épidémies chez l'homme. Nous examinons ici le potentiel de maladie d'un virus de type SRAS, SHC014-CoV, qui circule actuellement dans les populations chinoises de chauves-souris fer à cheval 1 . En utilisant le système de génétique inverse SARS-CoV 2 , nous avons généré et caractérisé un virus chimérique exprimant le pic de coronavirus de chauve-souris SHC014 dans un squelette SARS-CoV adapté à la souris.

Les résultats indiquent que les virus du groupe 2b codant pour le pic SHC014 dans un squelette de type sauvage peuvent utiliser efficacement plusieurs orthologues de l'enzyme II (ACE2) de conversion de l'angiotensine humaine du récepteur du SRAS, se répliquer efficacement dans les cellules des voies respiratoires humaines primaires et atteindre des  titres in vitro équivalents à souches épidémiques de SRAS-CoV. De plus,  des expériences in vivo démontrent la réplication du virus chimérique dans le poumon de souris avec une pathogenèse notable.

L'évaluation des modalités immunothérapeutiques et prophylactiques basées sur le SRAS a révélé une faible efficacité; les anticorps monoclonaux et l'approche vaccinale n'ont pas réussi à neutraliser et à protéger de l'infection par les CoV en utilisant la nouvelle protéine de pointe.

Sur la base de ces résultats, nous avons dérivé synthétiquement un virus recombinant SHC014 de pleine longueur infectieux et démontrons une réplication virale robuste à la fois  in vitro  et  in vivo . Nos travaux suggèrent un risque potentiel de réémergence du SRAS-CoV à partir de virus circulant actuellement dans les populations de chauves-souris.

Principale

L'émergence du SRAS-CoV a inauguré une nouvelle ère dans la transmission inter-espèces de maladies respiratoires graves, la mondialisation entraînant une propagation rapide dans le monde et un impact économique massif 3 , 4 . Depuis lors, plusieurs souches - y compris les souches de grippe A H5N1, H1N1 et H7N9, et MERS-CoV - ont émergé de populations animales, causant des maladies, une mortalité et des difficultés économiques considérables pour les régions touchées 5 . Bien que les mesures de santé publique aient pu arrêter l'épidémie de SRAS-CoV 4 , des études de métagénomique récentes ont identifié des séquences de virus de type SRAS étroitement apparentés circulant dans les populations de chauves-souris chinoises qui pourraient constituer une menace future 1 , 6 .

Cependant, les données de séquence à elles seules fournissent des informations minimales pour identifier et se préparer aux futurs virus prépandémiques. Par conséquent, d'examiner le potentiel d'émergence (qui est, le potentiel d'infecter les humains) de circulation CoV de chauve - souris, nous avons construit un virus chimérique codant pour une nouvelle séquence de protéines du RsSHC014-CoV de CoV zoonotique qui a été isolé des chauves - souris en fer à cheval chinois 1 —Dans le contexte du squelette adapté à la souris SARS-CoV. Le virus hybride nous a permis d'évaluer la capacité de la nouvelle protéine de pointe à provoquer une maladie indépendamment d'autres mutations adaptatives nécessaires dans son squelette naturel.

En utilisant cette approche, nous avons caractérisé l'infection par le CoV médiée par la protéine de pointe SHC014 dans les cellules des voies respiratoires humaines primaires et in vivo et avons  testé l'efficacité des thérapies immunitaires disponibles contre SHC014-CoV. Ensemble, la stratégie traduit les données de métagénomique pour aider à prédire et à se préparer aux futurs virus émergents.

Les séquences de SHC014 et du RsWIV1-CoV apparenté montrent que ces CoV sont les plus proches parents des souches épidémiques de SRAS-CoV (Fig. 1a,b ); cependant, il existe des différences importantes dans les 14 résidus qui se lient à l'ACE2 humaine, le récepteur du SRAS-CoV, y compris les cinq qui sont critiques pour la gamme d'hôtes: Y442, L472, N479, T487 et Y491 (réf.  7 ).

Dans WIV1, trois de ces résidus diffèrent de la souche épidémique SRAS-CoV Urbani, mais on ne s'attend pas à ce qu'ils altèrent la liaison à ACE2 (Supplementary Fig. 1a,b and Supplementary Table 1). Ce fait est confirmé par les deux expériences de pseudotypage qui mesuraient la capacité des lentivirus codant pour les protéines de pointe WIV1 à pénétrer dans les cellules exprimant l'ACE2 humaine ( figure 1 supplémentaire ) et par des   tests de réplication in vitro de WIV1-CoV (réf.  1 ). En revanche, 7 des 14 résidus d'interaction ACE2 dans SHC014 sont différents de ceux dans SARS-CoV, y compris les cinq résidus critiques pour la gamme d'hôtes ( Fig. 1c supplémentaire  et  tableau supplémentaire 1 ).

Ces changements, couplés à l'échec des lentivirus pseudotypés exprimant le pic SHC014 à pénétrer dans les cellules ( Fig. 1d supplémentaire ), ont suggéré que le pic SHC014 est incapable de se lier à ACE2 humain. Cependant, des changements similaires dans les souches de SRAS-CoV apparentées ont été signalés pour permettre la liaison à ACE2 7 , 8 , ce qui suggère que des tests fonctionnels supplémentaires étaient nécessaires pour la vérification.

Par conséquent, nous avons synthétisé le pic SHC014 dans le contexte du squelette du SRAS-CoV adapté à la souris et compétent pour la réplication (nous nous référons ci-après au CoV chimérique sous le nom de SHC014-MA15) pour maximiser l'opportunité d'études de pathogenèse et de vaccin chez la souris (Supplementary Fig. 2a ). Malgré les prédictions de la modélisation basée sur la structure et des expériences de pseudotypage, SHC014-MA15 était viable et répliqué à des titres élevés dans les cellules Vero ( Fig. 2b supplémentaire ). Semblable au SRAS, SHC014-MA15 nécessitait également une molécule ACE2 fonctionnelle pour l'entrée et pouvait utiliser des orthologues ACE2 humains, civettes et chauves-souris (Supplementary Fig. 2c,d).

Pour tester la capacité de la pointe de SHC014 à l' infection médiate des voies respiratoires humaines, nous avons examiné la sensibilité de la lignée cellulaire des voies respiratoires épithéliales humaines Calu-3 2B4 (réf.  9 ) à l' infection et on a trouvé la réplication SHC014-MA15 robuste, comparable à celle de SARS-CoV Urbani (Fig. 1c). Pour étendre ces résultats, des cultures d'épithélium des voies respiratoires humaines primaires (AOH) ont été infectées et ont montré une réplication robuste des deux virus (Fig. 1d)z :. Ensemble, les données confirment la capacité des virus avec le pic SHC014 à infecter les cellules des voies respiratoires humaines et soulignent la menace potentielle de transmission inter-espèces de SHC014-CoV.

Figure 1: Les virus de type SRAS se répliquent dans les cellules des voies respiratoires humaines et produisent  une  pathogenèse in vivo .
Figure 1

( a ) Les séquences génomiques de pleine longueur des CoV représentatifs ont été alignées et cartographiées phylogénétiquement comme décrit dans les méthodes en ligne  . La barre d'échelle représente les substitutions de nucléotides, seul le support bootstrap supérieur à 70% étant marqué. L'arbre montre les CoV divisés en trois groupes phylogénétiques distincts, définis comme les α-CoV, les β-CoV et les γ-CoV. Les clusters de sous-groupes classiques sont marqués comme 2a, 2b, 2c et 2d pour les β-CoV et comme 1a et 1b pour les α-CoV. ( b ) Les séquences d'acides aminés des domaines SI des pointes de ß-CoV représentatifs du groupe 2b, y compris SARS-CoV, ont été alignées et cartographiées phylogénétiquement. La barre d'échelle représente les substitutions d'acides aminés. ( c , d) Réplication virale du SRAS-CoV Urbani (noir) et SHC014-MA15 (vert) après infection de cellules Calu-3 2B4 ( c ) ou cultures de cellules AOH à interface air-liquide primaire bien différenciées ( d ) à une multiplicité d'infection (MOI) de 0,01 pour les deux types de cellules. Des échantillons ont été collectés à des moments individuels avec des répliques biologiques ( n  = 3) pour les expériences Calu-3 et HAE. ( e , f ) Perte de poids ( n  = 9 pour SARS-CoV MA15;  n  = 16 pour SHC014-MA15) ( e ) et réplication virale dans les poumons ( n  = 3 pour SARS-CoV MA15;  n  = 4 pour SHC014- MA15) ( f) Des souris âgées de 10 semaines BALB / c infectées avec 1 x 10 4  pfu du SRAS-CoV MA15 (noir) ou SHC014-MA15 (vert-adapté souris) par voie intranasale (in). ( g, h ) Des images représentatives de coupes pulmonaires colorées pour l'antigène SARS-CoV N provenant de souris infectées par SARS-CoV MA15 ( n =  3 souris) ( g ) ou SHC014-MA15 ( n  = 4 souris) ( h ) sont présentées. Pour chaque graphique, la valeur centrale représente la moyenne du groupe et les barres d'erreur définissent les barres d'échelle sem, 1 mm.

Image pleine grandeur

Pour évaluer le rôle du pic SHC014 dans la médiation de l'infection  in vivo , nous avons infecté des souris BALB / c âgées de 10 semaines avec 10 4  unités formant plaque (pfu) de SARS-MA15 ou SHC014-MA15 (Fig. 1e–h ). Les animaux infectés par le SRAS-MA15 ont connu une perte de poids rapide et une létalité 4 jours après l'infection (dpi); en revanche, l'infection par SHC014-MA15 a produit une perte de poids substantielle (10%) mais pas de létalité chez les souris (Fig. 1e ). L'examen de la réplication virale a révélé des titres viraux presque équivalents provenant des poumons de souris infectées par le SRAS-MA15 ou SHC014-MA15 (Fig. 1f). Alors que les poumons des souris infectées par le SRAS-MA15 ont montré une coloration robuste à la fois dans les bronchioles terminales et le parenchyme pulmonaire 2 dpi (Fig. 1g), ceux des souris infectées par SHC014-MA15 ont montré une coloration antigénique des voies respiratoires réduite (Fig. 1h ); en revanche, aucun déficit de coloration de l'antigène n'a été observé dans le parenchyme ou dans le score histologique global, suggérant une infection différentielle du tissu pulmonaire pour SHC014-MA15 ( tableau supplémentaire 2 ). Nous avons ensuite analysé l'infection chez des animaux âgés (âgés de 12 mois) plus sensibles. Les animaux infectés par le SRAS-MA15 ont rapidement perdu du poids et ont succombé à l'infection ( Fig. 3a, b  supplémentaires . SHC014-MA15 a induit une perte de poids robuste et soutenue, mais a une létalité minimale. Les tendances de l'histologie et des schémas de coloration de l'antigène que nous avons observés chez les jeunes souris ont été conservées chez les animaux plus âgés ( tableau supplémentaire 3). Nous avons exclu la possibilité que SHC014-MA15 médie l'infection par un récepteur alternatif sur la base d'expériences utilisant des  souris Ace2 - / -  , qui n'ont pas montré de perte de poids ou de coloration de l'antigène après l'infection SHC014-MA15 (Supplementary Fig. 4a,b and Supplementary Table 2 ). Ensemble, les données indiquent que les virus avec le pic SHC014 sont capables d'induire une perte de poids chez la souris dans le contexte d'un squelette virulent du CoV.

Compte tenu de l'efficacité préclinique des thérapies par anticorps monoclonaux Ebola, telles que ZMApp 10 , nous avons ensuite cherché à déterminer l'efficacité des anticorps monoclonaux contre le SRAS-CoV contre l'infection par SHC014-MA15. Quatre anticorps monoclonaux humains largement neutralisants ciblant la protéine de pointe du SRAS-CoV avaient déjà été rapportés et sont des réactifs probables pour l'immunothérapie 11 , 12 , 13 . Nous avons examiné l'effet de ces anticorps sur la réplication virale (exprimé en pourcentage d'inhibition de la réplication virale) et constaté que, alors que le SARS-CoV Urbani de type sauvage était fortement neutralisé par les quatre anticorps à des concentrations d'anticorps relativement faibles (Fig. 2a–d), la neutralisation a varié pour SHC014-MA15. Fm6, un anticorps généré par présentation de phage et mutants d'échappement 11 , 12 , atteint uniquement des niveaux de fond d'inhibition de la réplication de SHC014-MA15 (Fig. 2a ). De même, les anticorps 230.15 et 227.14, qui étaient dérivés de cellules B mémoire de patients infectés par le SRAS-CoV 13 , ont également échoué à bloquer la réplication de SHC014-MA15 (Fig. 2b,c). Pour les trois anticorps, les différences entre les séquences d'acides aminés du pic du SRAS et du SHC014 correspondaient aux changements de résidus directs ou adjacents trouvés dans les mutants d'échappement du SARS-CoV (fm6 N479R; 230,15 L443V; 227,14 K390Q / E), ce qui explique probablement l'absence des anticorps 'activité neutralisante contre SHC014. Enfin, l'anticorps monoclonal 109.8 a pu obtenir une neutralisation de 50% de SHC014-MA15, mais uniquement à des concentrations élevées (10 μg / ml) (Fig. 2d ). Ensemble, les résultats démontrent que les anticorps neutralisant largement contre le SARS-CoV peuvent n'avoir qu'une efficacité marginale contre les souches émergentes de CoV de type SRAS telles que SHC014.

Figure 2: Les anticorps monoclonaux contre le SRAS-CoV ont une efficacité marginale contre les CoV de type SRAS.
Figure 2

 ( a - d ) Essais de neutralisation évaluant l'efficacité (mesurée comme une réduction du nombre de plaques) d'un panel d'anticorps monoclonaux, qui ont tous été initialement générés contre l'épidémie de SRAS-CoV, contre l'infection des cellules Vero par SRAS-CoV Urbani (noir ) ou SHC014-MA15 (vert). Les anticorps testés étaient fm6 ( n  = 3 pour Urbani;  n  = 5 pour SHC014-MA15) 11 , 12  ( a ), 230,15 ( n  = 3 pour Urbani;  n  = 2 pour SHC014-MA15) ( b ), 227,15 ( n  = 3 pour Urbani;  n  = 5 pour SHC014-MA15) ( c ) et 109,8 ( n = 3 pour Urbani; n  = 2 pour SHC014-MA15) 13  ( d ). Chaque point de données représente la moyenne du groupe et les barres d'erreur définissent le sem. Notez que les barres d'erreur dans les cellules Vero infectées par SRAS-CoV Urbani dans  b , c  sont recouvertes par les symboles et ne sont pas visibles.

Image pleine grandeur

Pour évaluer l'efficacité des vaccins existants contre l'infection par SHC014-MA15, nous avons vacciné des souris âgées avec le SRAS-CoV (DIV) entier double inactivé. Des travaux antérieurs ont montré que DIV pouvait neutraliser et protéger les jeunes souris contre une provocation avec un virus homologue 14 ; cependant, le vaccin n'a pas réussi à protéger les animaux âgés chez lesquels une pathologie immunitaire augmentée a également été observée, ce qui indique la possibilité que les animaux soient lésés en raison de la vaccination 15 . Ici, nous avons constaté que DIV ne fournissait pas de protection contre la provocation avec SHC014-MA15 en ce qui concerne la perte de poids ou le titre viral (Supplementary Fig. 5a,b ). En accord avec un rapport précédent avec d'autres groupes hétérologues 2b CoVs 15, le sérum de souris âgées vaccinées par DIV n'a pas réussi non plus à neutraliser SHC014-MA15 (Supplementary Fig. 5c ). Notamment, la vaccination DIV a entraîné une pathologie immunitaire robuste ( tableau supplémentaire 4 ) et une éosinophilie ( figure supplémentaire 5d-f ). Ensemble, ces résultats confirment que le vaccin DIV ne serait pas protecteur contre l'infection par SHC014 et pourrait éventuellement augmenter la maladie dans le groupe vacciné âgé.

Contrairement à la vaccination de souris avec DIV, l'utilisation de SHC014-MA15 comme vaccin vivant atténué a montré une protection croisée potentielle contre la provocation avec le SRAS-CoV, mais les résultats comportent des mises en garde importantes. Nous avons infecté les jeunes souris avec 10 4  pfu de SHC014-MA15 et les avons observées pendant 28 jours. Nous avons ensuite provoqué les souris avec le SRAS-MA15 au jour 29 (Supplementary Fig. 6a ). L'infection antérieure des souris avec la dose élevée de SHC014-MA15 a conféré une protection contre la provocation avec une dose létale de SRAS-MA15, bien qu'il n'y ait eu qu'une réponse de neutralisation du SRAS-CoV minimale des antisérums provoqués 28 jours après l'infection par SHC014-MA15 Supplementary Fig. 6b, 1: 200). En l'absence d'un rappel d'antigène secondaire, 28 dpi représente le pic attendu des titres d'anticorps et implique qu'il y aura une protection diminuée contre le SRAS-CoV au fil du temps 16 , 17 . Des résultats similaires montrant une protection contre une provocation avec une dose létale de SRAS-CoV ont été observés chez des souris BALB / c âgées en ce qui concerne la perte de poids et la réplication virale (Supplementary Fig. 6c,d) . Cependant, la dose d'infection SHC014-MA15 de 10 4  pfu a induit une perte de poids et une létalité> 10% chez certains animaux âgés (Fig. 1 and Supplementary Fig. 3). Nous avons constaté que la vaccination avec une dose plus faible de SHC014-MA15 (100 pfu), n'a pas induit de perte de poids, mais elle a également échoué à protéger les animaux âgés contre une dose létale du SRAS-MA15 (Supplementary Fig. 6e,f ). Ensemble, les données suggèrent que la provocation SHC014-MA15 peut conférer une protection croisée contre le SRAS-CoV par le biais d'épitopes conservés, mais la dose requise induit une pathogenèse et empêche l'utilisation comme vaccin atténué.

Après avoir établi que le pic SHC014 a la capacité de médier l'infection des cellules humaines et de provoquer des maladies chez les souris, nous avons ensuite synthétisé un clone infectieux SHC014-CoV complet basé sur l'approche utilisée pour le SRAS-CoV (Fig. 3a ) 2 . La réplication dans les cellules Vero n'a révélé aucun déficit pour SHC014-CoV par rapport à celui pour SRAS-CoV (Fig. 3a ); cependant, SHC014-CoV était significativement  atténué ( P <0,01) dans les cultures primaires d'AOH à la fois 24 et 48 h après l'infection (Fig. 3c).  L'infection in vivo de souris n'a démontré aucune perte de poids significative, mais a montré une réplication virale réduite dans les poumons de l'infection SHC014-CoV pleine longueur, par rapport au SRAS-CoV Urbani (Fig. 3d,e). Ensemble, les résultats établissent la viabilité de SHC014-CoV pleine longueur, mais suggèrent qu'une adaptation supplémentaire est nécessaire pour que sa réplication soit équivalente à celle du SRAS-CoV épidémique dans les cellules respiratoires humaines et chez la souris.

Figure 3: SHC014-CoV pleine longueur se réplique dans les voies respiratoires humaines mais n'a pas la virulence du SRAS-CoV épidémique.
figure 3

 ( a ) Schéma du clone moléculaire SHC014-CoV, qui a été synthétisé sous forme de six ADNc contigus (désignés SHC014A, SHC014B, SHC014C, SHC014D, SHC014E et SHC014F) flanqués de sites BglI uniques qui ont permis l'assemblage dirigé de l'ADNc de pleine longueur exprimant cadres de lecture ouverts (pour 1a, 1b, spike, 3, enveloppe, matrice, 6–8 et nucléocapside). Les nucléotides soulignés représentent les séquences en surplomb formées après le clivage par l'enzyme de restriction. ( b , c ) Réplication virale du SRAS-CoV Urbani (noir) ou SHC014-CoV (vert) après infection de cellules Vero ( b ) ou cultures de cellules AOH à interface air-liquide primaire bien différenciées ( c) à un MOI de 0,01. Des échantillons ont été collectés à des moments individuels avec des répliques biologiques ( n  = 3) pour chaque groupe. Les données représentent une expérience pour les cellules Vero et HAE. ( d , e ) Perte de poids ( n  = 3 pour SARS-CoV MA15,  n  = 7 pour SHC014-CoV;  n  = 6 pour SRAS-Urbani) ( d ) et réplication virale dans les poumons ( n  = 3 pour SRAS-Urbani et SHC014-CoV) ( e ) de souris BALB / c âgées de 10 semaines infectées avec 1 × 10 5  pfu de SARS-CoV MA15 (gris), SHC014-CoV (vert) ou SARS-CoV Urbani (noir) via le en route. Chaque point de données représente la moyenne du groupe et les barres d'erreur définissent le sem **P  <0,01 et *** P  <0,001 en utilisant le test t de Student  bilatéral des points de temps individuels.

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Lors de l'épidémie de SRAS-CoV, des liens ont été rapidement établis entre les civettes de palmiers et les souches de CoV détectées chez l'homme 4 . Fort de ce constat, le paradigme de l' émergence commune soutient que l' épidémie de SRAS-CoV origine un virus de la chauve - souris, a sauté à civettes, et les changements incorporés dans le domaine de liaison au récepteur (RBD) pour améliorer la liaison à civette Ace2 (réf. 18 ). Une exposition ultérieure à des personnes sur les marchés d'animaux vivants a permis l'infection humaine par la souche de civette, qui, à son tour, s'est adaptée pour devenir la souche épidémique (Fig. 4a ). Cependant, l'analyse phylogénétique suggère que les premières souches du SRAS humain semblent plus étroitement liées aux souches de chauves-souris qu'aux souches de civettes 18. Par conséquent, un deuxième paradigme soutient que la transmission directe entre les chauves-souris et l'homme a déclenché l'émergence du SRAS-CoV et que les civettes de palmier ont servi d'hôte secondaire et de réservoir pour une infection continue (Fig. 4b ) 19 . Pour les deux paradigmes, l'adaptation des pics chez un hôte secondaire est considérée comme une nécessité, la plupart des mutations devant se produire dans le RBD, facilitant ainsi une infection améliorée. Les deux théories impliquent que les pools de CoV de chauves-souris sont limités et que les mutations de la gamme d'hôtes sont à la fois aléatoires et rares, ce qui réduit la probabilité d'événements d'émergence futurs chez l'homme.

Figure 4: Paradigmes d'émergence pour les coronavirus

figure4

Les souches de coronavirus sont maintenues dans des pools de quasi-espèces circulant dans les populations de chauves-souris. ( a , b ) Les théories traditionnelles d'émergence du SRAS-CoV postulent que les mutants de la gamme d'hôtes (cercle rouge) représentent des occurrences aléatoires et rares qui permettent l'infection d'hôtes alternatifs. Le paradigme de l'hôte secondaire ( a ) fait valoir qu'un hôte non humain est infecté par un virus progéniteur de chauve-souris et, par adaptation, facilite la transmission aux humains; la réplication ultérieure chez l'homme conduit à la souche virale épidémique. Le paradigme direct ( b) suggère que la transmission se produit entre les chauves-souris et les humains sans avoir besoin d'un hôte intermédiaire; la sélection se produit alors dans la population humaine avec des virus étroitement apparentés se répliquant dans un hôte secondaire, permettant une persistance virale continue et une adaptation dans les deux. ( c ) Les données des virus chimériques de type SRAS font valoir que les pools de quasi-espèces maintiennent plusieurs virus capables d'infecter des cellules humaines sans nécessiter de mutations (cercles rouges). Bien que des adaptations dans des hôtes secondaires ou humains puissent être nécessaires pour l'émergence d'une épidémie, si des virus contenant des pics SHC014 recombinés avec des squelettes virulents de CoV (cercles avec des contours verts), une maladie épidémique peut en résulter chez l'homme. Les données existantes prennent en charge les éléments des trois paradigmes.

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Bien que notre étude n'invalide pas les autres voies d'émergence, elle plaide en faveur d'un troisième paradigme dans lequel les pools de CoV de chauves-souris en circulation maintiennent des protéines de pointe `` en équilibre '' capables d'infecter les humains sans mutation ni adaptation (Fig. 4c ). Cette hypothèse est illustrée par la capacité d'un virus chimérique contenant le pic SHC014 dans un squelette SRAS-CoV à provoquer une infection robuste dans les cultures des voies respiratoires humaines et chez les souris sans adaptation RBD.

Couplés à l'observation de squelettes CoV pathogènes précédemment identifiés 3 , 20 , nos résultats suggèrent que les matériaux de départ nécessaires pour les souches émergentes de type SRAS circulent actuellement dans les réservoirs animaux. Notamment, bien que SHC014-CoV pleine longueur nécessite probablement une adaptation supplémentaire du squelette pour médier la maladie humaine, les événements de recombinaison à haute fréquence documentés dans les familles CoV soulignent la possibilité d'une émergence future et la nécessité d'une préparation supplémentaire.

À ce jour, les criblages génomiques des populations animales ont principalement été utilisés pour identifier de nouveaux virus dans les contextes d'épidémie 21 . L'approche ici étend ces ensembles de données pour examiner les questions d'émergence virale et d'efficacité thérapeutique. Nous considérons les virus avec le pic SHC014 comme une menace potentielle en raison de leur capacité à se répliquer dans les cultures primaires des voies respiratoires humaines, le meilleur modèle disponible pour la maladie humaine. De plus, la pathogenèse observée chez la souris indique une capacité des virus contenant SHC014 à provoquer une maladie chez des modèles mammifères, sans adaptation RBD.

Notamment, le tropisme différentiel dans le poumon par rapport à celui du SRAS-MA15 et l'atténuation du SHC014-CoV de pleine longueur dans les cultures d'AOH par rapport au SRAS-CoV Urbani suggèrent que des facteurs au-delà de la liaison ACE2 - y compris la processivité des pics, la biodisponibilité des récepteurs ou l'antagonisme des réponses immunitaires de l'hôte - peuvent contribuer à l'émergence. Cependant, des tests supplémentaires sur des primates non humains sont nécessaires pour traduire ces résultats en potentiel pathogène chez l'homme.

Surtout, l'échec des thérapies disponibles définit un besoin critique pour une étude plus approfondie et pour le développement de traitements. Avec ces connaissances, des programmes de surveillance, des réactifs de diagnostic et des traitements efficaces peuvent être produits qui protègent contre l'émergence de CoV spécifiques du groupe 2b, tels que SHC014, et ceux-ci peuvent être appliqués à d'autres branches de CoV qui maintiennent des pools également hétérogènes.

En plus d'offrir une préparation contre les futurs virus émergents, cette approche doit être envisagée dans le contexte de la pause imposée par le gouvernement américain sur les études sur le gain de fonction (GOF) 22 .

Sur la base des modèles d'émergence précédents (Fig. 4a,b ), la création de virus chimériques tels que SHC014-MA15 ne devrait pas augmenter la pathogénicité. Bien que SHC014-MA15 soit atténué par rapport à son SRAS-CoV parental adapté à la souris, des études similaires examinant la pathogénicité des CoV avec le pic Urbani de type sauvage dans le squelette MA15 n'ont montré aucune perte de poids chez la souris et une réplication virale réduite 23 . Ainsi, par rapport au pic Urbani – MA15 CoV, SHC014-MA15 montre un gain en pathogenèse (Fig. 1 ).

Sur la base de ces résultats, les groupes d'examen scientifique peuvent juger des études similaires construisant des virus chimériques basés sur des souches en circulation trop risquées à poursuivre, car une pathogénicité accrue dans les modèles mammifères ne peut être exclue.

Associée à des restrictions sur les souches adaptées à la souris et au développement d'anticorps monoclonaux utilisant des mutants d'échappement, la recherche sur l'émergence du CoV et l'efficacité thérapeutique peut être sévèrement limitée à l'avenir. Ensemble, ces données et restrictions représentent un carrefour des préoccupations de recherche du GOF; le potentiel de préparation et d'atténuation des épidémies futures doit être mis en balance avec le risque de créer des agents pathogènes plus dangereux. Lors de l'élaboration des politiques à l'avenir, il est important de considérer la valeur des données générées par ces études et de déterminer si ces types d'études sur les virus chimériques justifient une enquête plus approfondie par rapport aux risques inhérents impliqués.

Dans l'ensemble, notre approche a utilisé des données de métagénomique pour identifier une menace potentielle posée par le CoV SHC014 de type SRAS de chauve-souris en circulation. En raison de la capacité des virus SHC014 chimériques à se répliquer dans les cultures des voies respiratoires humaines, à provoquer une pathogenèse  in vivo  et à échapper aux thérapies actuelles, il existe un besoin à la fois de surveillance et de traitements améliorés contre les virus de type SRAS en circulation. Notre approche débloque également l'utilisation des données de métagénomique pour prédire l'émergence virale et appliquer ces connaissances pour se préparer à traiter les futures infections virales émergentes.

Méthodes

Virus, cellules,  infections in vitro et tests de plaque

Le SARS-CoV de type sauvage (Urbani), le SARS-CoV (MA15) adapté à la souris et les CoV chimériques semblables au SRAS ont été cultivés sur des cellules Vero E6 (obtenues auprès de l'Institut de recherche médicale de l'armée des États-Unis sur les maladies infectieuses), cultivées dans le Eagle modifié de Dulbecco. milieu (DMEM) (Gibco, CA) et 5% de sérum de clone foetal (FCS) (Hyclone, South Logan, UT) avec un antibiotique / antimycotique (Gibco, Carlsbad, CA). Des cellules DBT (laboratoire Baric, source inconnue) exprimant des   orthologues ACE2 ont été précédemment décrites pour l'homme et la civette; La  séquence bat  Ace2 était basée sur celle de  Rhinolophus leschenaulti , et les cellules DBT exprimant bat  Ace2  ont été établies comme décrit précédemment 8 .

Les expériences de pseudotypage étaient similaires à celles utilisant un pseudovirus basé sur le VIH, préparé comme décrit précédemment 10 , et examinés sur des cellules HeLa (Wuhan Institute of Virology) qui exprimaient des   orthologues ACE2 . Les cellules HeLa ont été cultivées dans un milieu essentiel minimal (MEM) (Gibco, CA) supplémenté avec 10% de FCS (Gibco, CA) comme décrit précédemment 24 .

Les courbes de croissance dans Vero E6, DBT, Calu-3 2B4 et les cellules épithéliales des voies aériennes humaines primaires ont été réalisées comme décrit précédemment 8 , 25 . Aucun des stocks de lignées cellulaires de travail n'a été authentifié ou testé récemment pour le mycoplasme, bien que les stocks de semences d'origine utilisés pour créer les stocks de travail soient exempts de contamination. Les poumons humains pour les cultures d'AOH ont été achetés dans le cadre de protocoles approuvés par le Conseil d'examen institutionnel de l'Université de Caroline du Nord à Chapel Hill. Les cultures d'AOH représentent un épithélium des voies respiratoires humaines hautement différencié contenant des cellules épithéliales ciliées et non ciliées ainsi que des cellules caliciformes. Les cultures sont également cultivées sur une interface air-liquide pendant plusieurs semaines avant utilisation, comme décrit précédemment 26 .

En bref, les cellules ont été lavées avec du PBS et inoculées avec le virus ou diluées de façon simulée dans du PBS pendant 40 minutes à 37 ° C. Après inoculation, les cellules ont été lavées trois fois et un milieu frais a été ajouté pour signifier le temps «0». Au moins trois réplicats biologiques ont été récoltés à chaque instant décrit. Aucun aveugle n'a été utilisé dans les collections d'échantillons et les échantillons n'ont pas été randomisés. Toutes les cultures de virus ont été réalisées dans un laboratoire de niveau de sécurité biologique (BSL) 3 avec des ventilateurs redondants dans les enceintes de sécurité biologique, comme décrit précédemment par notre groupe 2 . Tout le personnel portait des respirateurs à épuration d'air motorisés (Breathe Easy, 3M) avec des combinaisons Tyvek, des tabliers et des chaussons et portait deux gants.

Clustering de séquences et modélisation structurelle.

Les séquences génomiques complètes et les séquences d'acides aminés des domaines S1 du pic de CoV représentatifs ont été téléchargées à partir de Genbank ou Pathosystems Resource Integration Center (PATRIC), alignées avec ClustalX et comparées phylogénétiquement en utilisant l'estimation du maximum de vraisemblance à l'aide de 100 bootstraps ou par en utilisant le package PhyML , respectivement. L'arbre a été généré en utilisant le maximum de vraisemblance avec le package PhyML. La barre d'échelle représente les substitutions de nucléotides. Seuls les nœuds avec un support d'amorçage supérieur à 70% sont étiquetés.

L'arbre montre que les CoV sont divisés en trois groupes phylogénétiques distincts définis comme les α-CoV, les β-CoV et les γ-CoV. Les clusters de sous-groupes classiques sont marqués comme 2a, 2b, 2c et 2d pour les β-CoV, et 1a et 1b pour les α-CoV. Des modèles structurels ont été générés à l'aide de Modeller (Max Planck Institute Bioinformatics Toolkit) pour générer des modèles d'homologie pour SHC014 et Rs3367 du SRAS RBD en complexe avec ACE2 basé sur la structure cristalline 2AJF  (Protein Data Bank). Les modèles d'homologie ont été visualisés et manipulés dans MacPyMol (version 1.3).

Construction de virus chimériques de type SRAS.

Les virus de type sauvage et chimériques sont dérivés soit du SARS-CoV Urbani, soit du clone infectieux (ic) adapté à la souris correspondant (SARS-CoV MA15) comme décrit précédemment 27 . Les plasmides contenant des séquences de pic pour SHC014 ont été extraits par digestion de restriction et ligaturés dans les plasmides E et F du clone infectieux MA15. Le clone a été conçu et acheté auprès de Bio Basic sous forme de six ADNc contigus en utilisant des séquences publiées flanquées de sites d'endonucléase de restriction de classe II uniques (BglI). Par la suite, des plasmides contenant des fragments de génome de SARS-CoV chimériques de type sauvage et de SHC014-CoV ont été amplifiés, excisés, ligaturés et purifiés.

Des réactions de transcription in vitro ont ensuite été effectuées pour synthétiser de l'ARN génomique de pleine longueur, qui a été transfecté dans des cellules Vero E6 comme décrit précédemment 2 . Le milieu des cellules transfectées a été récolté et a servi de stocks de graines pour des expériences ultérieures. Les virus chimériques et de pleine longueur ont été confirmés par analyse de séquence avant utilisation dans ces études. La construction synthétique du mutant chimérique SHC014-CoV de pleine longueur a été approuvée par le comité de biosécurité institutionnelle de l'Université de Caroline du Nord et le comité de recherche à double usage sur les préoccupations.

Déclaration éthique

Cette étude a été réalisée conformément aux recommandations pour le soin et l'utilisation des animaux par l'Office of Laboratory Animal Welfare (OLAW), NIH. Le comité institutionnel de soin et d'utilisation des animaux (IACUC) de l'Université de Caroline du Nord à Chapel Hill (UNC, numéro de permis A-3410-01) a approuvé le protocole d'étude sur les animaux (IACUC # 13-033) utilisé dans ces études.

Souris et  infection in vivo

Des souris BALB / cAnNHsD femelles, âgées de 10 semaines et 12 mois ont été commandées aux laboratoires Harlan. Les infections de souris ont été effectuées comme décrit précédemment 20 . En bref, les animaux ont été amenés dans un laboratoire BSL3 et autorisés à s'acclimater pendant 1 semaine avant l'infection. Pour l'infection et la vaccination contre le virus vivant atténué, les souris ont été anesthésiées avec un mélange de kétamine et de xylazine et infectées par voie intranasale, lorsqu'elles sont stimulées, avec 50 pi de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) ou de virus dilué avec trois ou quatre souris par point de temps, par groupe d'infection par dose comme décrit dans les légendes de la figure.

Pour les souris individuelles, les notations d'infection, y compris l'échec de l'inhalation de la dose entière, la formation de bulles d'inoculum par le nez ou l'infection par la bouche, peuvent avoir conduit à l'exclusion des données sur les souris à la discrétion du chercheur; post-infection, aucun autre critère d'exclusion ou d'inclusion préétabli n'est défini. Aucun aveugle n'a été utilisé dans les expériences sur les animaux et les animaux n'ont pas été randomisés. Pour la vaccination, des souris jeunes et âgées ont été vaccinées par injection de coussinet plantaire avec un volume de 20 μl de 0,2 μg de vaccin contre le SRAS-CoV double inactivé avec de l'alun ou du PBS simulé; les souris ont ensuite été soumises à un rappel avec le même régime 22 jours plus tard et soumises à une provocation 21 jours par la suite. Pour tous les groupes, selon le protocole, les animaux ont été surveillés quotidiennement pour détecter les signes cliniques de maladie (courbure, fourrure ébouriffée et activité réduite) pendant la durée de l'expérience.La perte de poids a été surveillée quotidiennement pendant les 7 premiers jours, après quoi la surveillance du poids s'est poursuivie jusqu'à ce que les animaux récupèrent leur poids de départ initial ou affichent un gain de poids en continu pendant 3 jours.

Toutes les souris qui ont perdu plus de 20% de leur poids corporel de départ ont été nourries au sol et surveillées plusieurs fois par jour tant qu'elles étaient sous le seuil de 20%. Les souris qui ont perdu plus de 30% de leur poids corporel de départ ont été immédiatement sacrifiées selon le protocole. Toute souris jugée moribonde ou peu susceptible de récupérer a également été sacrifiée humainement à la discrétion du chercheur. L'euthanasie a été réalisée en utilisant une surdose d'isoflurane et la mort a été confirmée par luxation cervicale. Toutes les études sur les souris ont été réalisées à l'Université de Caroline du Nord (Animal Welfare Assurance # A3410-01) en utilisant des protocoles approuvés par le Comité institutionnel de soin et d'utilisation des animaux de l'UNC (IACUC).

Analyse histologique.

Le poumon gauche a été prélevé et immergé dans du formol tamponné à 10% (Fisher) sans gonflage pendant 1 semaine. Les tissus ont été inclus dans de la paraffine et des coupes de 5 μm ont été préparées par le centre d'histopathologie UNC Lineberger Comprehensive Cancer Center. Pour déterminer l'étendue de la coloration de l'antigène, les coupes ont été colorées pour l'antigène viral en utilisant un anticorps anti-nucléocapside polyclonal SARS-CoV disponible dans le commerce (Imgenex) et notées en aveugle par pour la coloration des voies respiratoires et du parenchyme comme décrit précédemment 20 . Les images ont été capturées à l'aide d'un microscope Olympus BX41 avec une caméra Olympus DP71.

Tests de neutralisation virale.

Des dosages de titre de neutralisation de réduction de plaque ont été réalisés avec des anticorps préalablement caractérisés contre le SRAS-CoV, comme décrit précédemment 11 ,

12 , 13

. En bref, des anticorps neutralisants ou du sérum ont été dilués en série deux fois et incubés avec 100 pfu des différentes souches de clone infectieux, SARS-CoV, pendant 1 h à 37 ° C. Le virus et d' anticorps ont ensuite été ajoutés à une plaque à 6 puits avec 5 x 10 5  cellules Vero E6 / puits avec de multiples répétitions ( n ≥ 2). Après une incubation d'une heure à 37 ° C, les cellules ont été recouvertes de 3 ml d'agarose à 0,8% dans un milieu. Les plaques ont été incubées pendant 2 jours à 37 ° C, colorées avec du rouge neutre pendant 3 h et les plaques ont été comptées. Le pourcentage de réduction de plaque a été calculé comme suit: (1 - (nombre de plaques avec un anticorps / nombre de plaques sans anticorps)) x 100.

analyses statistiques

Toutes les expériences ont été menées en opposant deux groupes expérimentaux (soit deux virus, soit des cohortes vaccinées et non vaccinées). Par conséquent, des différences significatives dans le titre viral et la notation histologique ont été déterminées par un test t de Student  bilatéral à des moments individuels. Les données étaient normalement distribuées dans chaque groupe comparé et avaient une variance similaire.

Biosécurité et biosécurité

Les études rapportées ont été lancées après que le comité de biosécurité institutionnel de l'Université de Caroline du Nord a approuvé le protocole expérimental (Titre du projet: Génération de clones infectieux de CoV de chauve-souris de type SRAS; ID du plan de sécurité du laboratoire: 20145741; ID de l'annexe G: 12279).

Ces études ont été lancées avant la suspension du financement de la recherche sur le processus délibératif du gouvernement américain sur une sélection de recherche sur le gain de fonction impliquant des virus de la grippe, du MERS et du SRAS . Ce document a été révisé par l'agence de financement, le NIH. La poursuite de ces études a été demandée, et cela a été approuvé par le NIH.

SARS-CoV est un agent de sélection. Tous les travaux relatifs à ces études ont été effectués avec des procédures opérationnelles normalisées (SOP) et des conditions de sécurité approuvées pour le SRAS-CoV, les MERs-CoV et d'autres CoV connexes. Nos installations institutionnelles CoV BSL3 ont été conçues pour se conformer aux exigences de sécurité recommandées par le Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (BMBL), le US Department of Health and Human Services, le Public Health Service, les Centers for Disease Control (CDC ) et le NIH. Des plans de sécurité du laboratoire ont été soumis et l'installation a été approuvée pour utilisation par le Département de la santé et de la sécurité environnementales (EHS) de l'UNC et le CDC. Un accès par carte électronique est nécessaire pour entrer dans l'établissement.

Tous les travailleurs ont été formés par EHS pour utiliser en toute sécurité des respirateurs à épuration d'air motorisés (PAPR), et des habitudes de travail appropriées dans une installation BSL3 et des plans de surveillance médicale active sont en place. Nos installations CoV BSL3 contiennent des ventilateurs redondants, une alimentation de secours pour les ventilateurs et les armoires et congélateurs de sécurité biologique, et nos installations peuvent accueillir des racks de souris SealSafe. Les matériaux classés comme agents BSL3 sont constitués de SARS-CoV, de souches précurseurs de chauve-souris CoV, de MERS-CoV et de mutants dérivés de ces agents pathogènes. Au sein des installations BSL3, l'expérimentation d'un virus infectieux est réalisée dans une armoire de biosécurité (BSC) de classe II certifiée.

Tous les membres du personnel portent des gommages, des combinaisons et des tabliers Tyvek, des PAPR et des couvre-chaussures, et leurs mains portent des gants doubles. Les utilisateurs de BSL3 sont soumis à un plan de surveillance médicale surveillé par la clinique de santé au travail des employés de l'université (UEOHC), qui comprend une vaccination annuelle contre la grippe physique et annuelle et la déclaration obligatoire de tout symptôme associé à une infection au CoV pendant les périodes de travail dans le BSL3. Tous les utilisateurs de BSL3 sont formés à la gestion de l'exposition et aux protocoles de notification, sont préparés à l'auto-quarantaine et ont été formés pour être livrés en toute sécurité à un service local de gestion des maladies infectieuses en cas d'urgence. Tous les événements d'exposition potentiels sont signalés et étudiés par l'EHS et l'UEOHC, avec des rapports déposés à la fois au CDC et au NIH.



Source:  Téléchargement gratuit MP3 de OUT OF CONTROL sur SoundCloud.com


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2 commentaires:

  1. En France le Professeur Fortillan qui dénonce l'Institut Pasteur avec une plainte pénale est mis aux arrêts à Nîmes puis transféré dans un hôpital psychiatrique dans le sud de la France. Son crime avoir dénoncé les manipulations du COVID 19. Le Dr Lévy est juif, sa femme Buzin aussi.

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  2. REMEMBER

    https://www.cnbc.com/2020/06/09/harvard-professor-indicted-for-false-statements-about-work-in-wuhan.html

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