mardi 24 mars 2020

COVID-19 : arme biologique créée en Caroline du Nord, financée par la CIA, mais Trump accuse la Chine


Les documents ci-dessous montreront que la recherche pour créer COVID 19 a commencé aux États-Unis en 2006 et a abouti à une bio-arme réussie en 2015, avec des travaux effectués à l'Université de Caroline du Nord et à Harvard et au laboratoire de la Food and Drug Administration en Arkansas.  Leur travail était intitulé:
Un groupe de coronavirus de chauves-souris en circulation ressemblant au SRAS montre un potentiel d'émergence humaine
Ils ont fait cela et bien plus encore, comme vous pourrez le lire ci-dessous.
Comme Trump l'a dit, encore et encore, les Chinois étaient impliqués.
Laboratoire clé des agents pathogènes spéciaux et de la biosécurité, Institut de virologie de Wuhan, Académie chinoise des sciences, Wuhan ; la Chine a fourni le virus de la chauve-souris de Wuhan qui a été utilisé dans l'étude américaine. Leur nom (virus chinois) n'a été inclus que pour cette raison.
COVID 19 était un projet d'armes biologiques de l'armée américaine visant à fabriquer une pneumonie causant une maladie qu'il serait presque impossible de vacciner chez des patients de plus de 40 ans.
La preuve est là, faites simplement défiler vers le bas. L'étude a été dirigée par l'Université de Caroline du Nord et financée par USAID / CIA. Ils ont choisi un virus de chauve-souris chinois et ont également choisi d'inclure un centre médical à Wuhan.
Maintenant, nous savons pourquoi, un écran de fumée de condamnations pour un programme auquel la Chine avait peu ou rien à voir, quelque chose de sataniquement mauvais et purement américain.
En novembre 2015, une étude a été publiée décrivant la capacité de produire le virus dont nous traitons actuellement. Parmi les nombreux participants, il y avait un laboratoire à Wuhan, en Chine. Il a été répertorié dès le début comme l'une des dizaines d’équipes, principalement américaines, travaillant sur ce projet.
Cependant, un participant clé a été laissé de côté, l'USAID. On soupçonne, profondément, que l'USAID est un front pour la recherche américaine sur la bio-guerre telle que celle faite à Tbilissi, en Géorgie et ailleurs, très documentée [1]. C'est la citation qui ajoute l'USAID au groupe de financement de la recherche.
Changer l'historique
20 novembre 2015
Dans la version de cet article initialement publiée en ligne, les auteurs ont omis de mentionner une source de financement, le financement USAID-EPT-PREDICT d'EcoHealth Alliance, à Z.-L.S. L'erreur a été corrigée pour les versions imprimée, PDF et HTML de cet article.
Nous allons maintenant présenter l'article biaisé de Pravda et, ci-dessous, l'étude réelle prouvant la capacité de produire COVID-19, prouvant, une fois pour toutes, que ce n'est pas un virus naturel.
Quant à savoir qui a fait quoi, ce n'est pas notre travail, mais nous prouvons, catégoriquement, que lorsqu'un laboratoire chinois est mentionné, il est un acteur mineur dans un effort américain, comme indiqué de manière exhaustive ci-dessous.
Cela rend peut-être le laboratoire de Wuhan complice de la guerre biologique.
De même, lorsque Forbes Magazine et d'autres ont déclaré qu'ils pouvaient prouver que COVID-19 était fabriqué naturellement, et bien sûr, ils avaient le même accès que nous, nous soupçonnons qu'ils font partie d'un effort de désinformation lié à l'USAID et à la guerre biologique.
La suspicion n'est pas la preuve. La preuve est une preuve mais il y a suffisamment de preuves évidentes. Nos remerciements aux professionnels américains de la santé qui ont vendu leur âme à l'armée américaine et à la CIA et qui nous ont amenés là où nous en sommes maintenant, une nation brisée en mille morceaux.
Pravda.Ru: De tels documents sont apparus en 2015 sur le site Web de la revue scientifique Natura en 2015. Ensuite, les auteurs ont affirmé qu'après l'avènement du virus du SRAS (2002-2003) et du syndrome respiratoire du Moyen-Orient (MERS) [2], les scientifiques étaient au courant du risque de transmission interspécifique qui conduirait à une épidémie parmi les populations.
Expérience de laboratoire réussie
L'équipe de recherche a notamment étudié les chauves-souris, qui sont les plus grands incubateurs de coronavirus. Néanmoins, les chauves-souris ne pouvaient pas transmettre le coronavirus à l'homme car elles ne pouvaient pas interagir avec les cellules humaines avec les récepteurs ACE2.
Le matériel a également déclaré que les chauves-souris en fer à cheval portent une souche de coronavirus du SRAS qui peut être transmise à l'homme. Il a été nommé virus SHC014-CoV.
Pour mieux étudier ce virus, les scientifiques ont copié le coronavirus et l'ont infecté avec des souris de laboratoire. Les résultats ont montré que le virus est vraiment capable de se lier aux cellules humaines avec les récepteurs ACE2 et de se multiplier dans les cellules du système respiratoire.
Dans le travail de recherche, il est noté que le matériel, les échantillons et l'équipement de laboratoire qui ont été utilisés dans la recherche ont été obtenus auprès de l'Institut de recherche médicale de l'armée sur les maladies infectieuses. Cependant, il n’est pas encore possible de dire avec certitude que le virus qui a été testé sur des souris de laboratoire est le même que le coronavirus SARS-Cove-2.
Politique de l'OTAN
Cependant, des choses intéressantes peuvent être trouvées dans des documents antérieurs. Par exemple:
• Le rapport d'activité de l'Alliance 2019 indique qu'en 2019, la première place de l'Alliance dans la recherche et le développement était occupée par le thème de la protection radiochimique et biologique (29%), déplaçant le problème apparemment le plus pressant de l'Europe - la lutte contre le terrorisme (devenue en 4e  priorité).
• Un an plus tôt, en 2018, la situation était exactement l'inverse: le terrorisme, comme il se doit, était en premier lieu (28%) et la protection radiochimique et biologique en quatrième (13%).
Comme l'écrit le mouchard de Bruxelles dans la chaîne des télégrammes, étant donné l'absence de raisons visibles pour un changement aussi marqué des intérêts scientifiques, il y a deux options et les deux sont désagréables:
• ou bien l'OTAN agite maintenant le cinquième point, falsifiant les données pour montrer "et nous nous sommes toujours préparés aux virus, nous sommes modernes",
• ou bien, même en 2019 dans l'alliance, Dieu me pardonne, ils savaient d'où viendraient les ennuis.
Oui, la première option est beaucoup plus réelle, mais, voyez-vous, les faits sont surprenants. "
Читайте больше на https://www.pravda.ru/world/1482450-COVID19/
Recherche originale de 2015 non révisée et complète
Un groupe de coronavirus de chauves-souris en circulation ressemblant au SRAS montre un potentiel d'émergence humaine
Medicine volume 21, pages1508–1513 (2015) Citer cet article
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• Un rectificatif à cet article a été publié le 06 avril 2016
       Cet article a été mis à jour
Résumé
L'émergence du coronavirus du syndrome respiratoire aigu sévère (SRAS-CoV) et du syndrome respiratoire du Moyen-Orient (MERS) -CoV souligne la menace d'événements de transmission inter-espèces conduisant à des épidémies chez l'homme. Nous examinons ici le potentiel de maladie d'un virus de type SRAS, SHC014-CoV, qui circule actuellement dans les populations de chauves-souris chinoises en fer à cheval1. En utilisant le système de génétique inverse SARS-CoV2, nous avons généré et caractérisé un virus chimérique exprimant le pic du coronavirus de chauve-souris SHC014 dans un squelette SARS-CoV adapté à la souris. Les résultats indiquent que les virus du groupe 2b codant pour le pic SHC014 dans un squelette de type sauvage peuvent utiliser efficacement plusieurs orthologues de l'enzyme de conversion de l'angiotensine humaine II (ACE2), se répliquer efficacement dans les cellules des voies respiratoires humaines primaires et atteindre des titres in vitro équivalents à une épidémie souches de SARS-CoV. De plus, des expériences in vivo démontrent la réplication du virus chimérique dans le poumon de souris avec une pathogenèse notable. L'évaluation des modalités immunothérapeutiques et prophylactiques basées sur le SRAS a révélé une faible efficacité; les approches à base d'anticorps monoclonaux et de vaccins n'ont pas réussi à neutraliser et à protéger contre l'infection par les CoV en utilisant la nouvelle protéine de pointe. Sur la base de ces résultats, nous avons dérivé synthétiquement un virus recombinant SHC014 infectieux de pleine longueur et démontrons une réplication virale robuste à la fois in vitro et in vivo. Nos travaux suggèrent un risque potentiel de réémergence du SRAS-CoV à partir de virus circulant actuellement dans les populations de chauves-souris.
Partie Principale
L'émergence du SRAS-CoV a inauguré une nouvelle ère dans la transmission interespèces de maladies respiratoires graves, la mondialisation entraînant une propagation rapide dans le monde et un impact économique massif3,4. Depuis lors, plusieurs souches - dont les souches de grippe A H5N1, H1N1 et H7N9 et MERS-CoV - ont émergé des populations animales, causant des maladies, une mortalité et des difficultés économiques considérables pour les régions touchées5. Bien que des mesures de santé publique aient pu arrêter l'épidémie de SRAS-CoV4, de récentes études métagénomiques ont identifié des séquences de virus de type SRAS étroitement apparentés circulant dans les populations de chauves-souris chinoises qui pourraient constituer une menace future1,6. Cependant, les données de séquence à elles seules fournissent un minimum d'informations pour identifier et préparer les futurs virus prépandémiques. Par conséquent, pour examiner le potentiel d'émergence (c'est-à-dire le potentiel d'infecter les humains) des CoV de chauve-souris en circulation, nous avons construit un virus chimérique codant pour une nouvelle protéine de pointe de CoV zoonotique - à partir de la séquence RsSHC014-CoV qui a été isolée des chauves-souris chinoises en fer à cheval1 - dans le cadre du squelette SARS-CoV adapté aux souris. Le virus hybride nous a permis d'évaluer la capacité de la nouvelle protéine de pointe à provoquer une maladie indépendamment des autres mutations adaptatives nécessaires dans son squelette naturel. En utilisant cette approche, nous avons caractérisé l'infection au CoV médiée par la protéine de pointe SHC014 dans les cellules des voies aériennes humaines primaires et in vivo, et testé l'efficacité des thérapies immunitaires disponibles contre SHC014-CoV. Ensemble, la stratégie traduit les données de métagénomique pour aider à prévoir et à préparer les futurs virus émergents.
Les séquences de SHC014 et du RsWIV1-CoV apparenté montrent que ces CoV sont les plus proches parents des souches épidémiques du SRAS-CoV (Fig. 1a, b); cependant, il existe des différences importantes dans les 14 résidus qui se lient à l'ACE2 humain, le récepteur du SRAS-CoV, y compris les cinq qui sont critiques pour la gamme d'hôtes: Y442, L472, N479, T487 et Y491 (réf.7). Dans WIV1, trois de ces résidus diffèrent de la souche épidémique SARS-CoV Urbani, mais on ne s'attendait pas à ce qu'ils altèrent la liaison à ACE2 (Fig. 1a, b et Tableau 1). Ce fait est confirmé à la fois par des expériences de pseudotypage qui ont mesuré la capacité des lentivirus codant pour des protéines de pointe WIV1 à pénétrer dans des cellules exprimant l'ACE2 humaine (Fig.1 supplémentaire) et par des tests de réplication in vitro de WIV1-CoV (réf.1). En revanche, 7 des 14 résidus d'interaction ACE2 dans SHC014 sont différents de ceux dans SARS-CoV, y compris les cinq résidus critiques pour la gamme d'hôtes (figure supplémentaire 1c et tableau supplémentaire 1). Ces changements, couplés à l'échec des lentivirus pseudotypés exprimant la pointe SHC014 à pénétrer dans les cellules (figure supplémentaire 1d), suggèrent que la pointe SHC014 est incapable de se lier à l'ACE2 humain. Cependant, des changements similaires dans les souches associées du SRAS-CoV avaient été signalés pour permettre la liaison de l'ACE27,8, suggérant que des tests fonctionnels supplémentaires étaient nécessaires pour la vérification. Par conséquent, nous avons synthétisé la pointe SHC014 dans le contexte du squelette SARS-CoV adapté à la réplication (adapté à la souris) (nous désignerons ci-après le CoV chimérique SHC014-MA15) afin de maximiser l'opportunité d'études de pathogenèse et de vaccins chez la souris (Fig supplémentaire . 2a). Malgré les prédictions à la fois de la modélisation basée sur la structure et des expériences de pseudotypage, SHC014-MA15 était viable et répliqué à des titres élevés dans les cellules Vero (figure supplémentaire 2b). De façon similaire au SRAS, SHC014-MA15 nécessitait également une molécule ACE2 fonctionnelle pour l'entrée et pouvait utiliser des orthologues ACE2 humains, civettes et chauves-souris (figure supplémentaire 2c, d). Pour tester la capacité de la pointe SHC014 à médier l'infection des voies respiratoires humaines, nous avons examiné la sensibilité de la lignée cellulaire des voies respiratoires épithéliales humaines Calu-3 2B4 (réf. 9) à l'infection et trouvé une réplication SHC014-MA15 robuste, comparable à celle de SARS-CoV Urbani (figure 1c). Pour étendre ces résultats, les cultures primaires d'épithélium des voies respiratoires humaines (AOH) ont été infectées et ont montré une réplication robuste des deux virus (Fig. 1d). Ensemble, les données confirment la capacité des virus avec la pointe SHC014 à infecter les cellules des voies respiratoires humaines et soulignent la menace potentielle de transmission inter-espèces de SHC014-CoV.
figure1Figure 1: Les virus de type SRAS se répliquent dans les cellules des voies respiratoires humaines et produisent une pathogenèse in vivo.
(a) Les séquences génomiques complètes de CoV représentatifs ont été alignées et cartographiées phylogénétiquement comme décrit dans les Méthodes en ligne. La barre d'échelle représente les substitutions de nucléotides, seul le support bootstrap supérieur à 70% étant marqué. L'arbre montre les CoV divisés en trois groupes phylogénétiques distincts, définis comme α-CoV, β-CoV et γ-CoV. Les grappes de sous-groupes classiques sont marquées comme 2a, 2b, 2c et 2d pour les β-CoV et comme 1a et 1b pour les α-CoV. (b) Les séquences d'acides aminés des domaines S1 des pointes des β-CoV représentatifs du groupe 2b, y compris le SARS-CoV, ont été alignées et cartographiées phylogénétiquement. La barre d'échelle représente les substitutions d'acides aminés. (c, d) Réplication virale de SARS-CoV Urbani (noir) et SHC014-MA15 (vert) après infection de cellules Calu-3 2B4 (c) ou cultures de cellules HAE à interface air-liquide primaire bien différenciées (d) à une multiplicité d'infection (MOI) de 0,01 pour les deux types de cellules. Des échantillons ont été prélevés à des moments individuels avec des répliques biologiques (n = 3) pour les expériences Calu-3 et HAE. (e, f) Perte de poids (n = 9 pour SARS-CoV MA15; n = 16 pour SHC014-MA15) (e) et réplication virale dans les poumons (n ​​= 3 pour SARS-CoV MA15; n = 4 pour SHC014- MA15) (f) de souris BALB / c âgées de 10 semaines infectées par 1 × 104 pfu de SARS-CoV MA15 adapté aux souris (noir) ou SHC014-MA15 (vert) par voie intranasale (i.n.). (g, h) Des images représentatives de coupes pulmonaires colorées pour l'antigène SARS-CoV N de souris infectées par SARS-CoV MA15 (n = 3 souris) (g) ou SHC014-MA15 (n = 4 souris) (h) sont montrées. Pour chaque graphique, la valeur centrale représente la moyenne du groupe et les barres d'erreur définissent la valeur s.e.m. Barres d'échelle, 1 mm.
Pour évaluer le rôle du pic SHC014 dans la médiation de l'infection in vivo, nous avons infecté des souris BALB / c âgées de 10 semaines avec 104 unités formatrices de plaque (pfu) de SARS-MA15 ou SHC014-MA15 (Fig. 1e – h) . Les animaux infectés par le SRAS-MA15 ont connu une perte de poids rapide et une létalité 4 jours après l'infection (d.p.i.); en revanche, l'infection par SHC014-MA15 a produit une perte de poids substantielle (10%) mais aucune létalité chez la souris (figure 1e). L'examen de la réplication virale a révélé des titres viraux presque équivalents dans les poumons de souris infectées par le SRAS-MA15 ou SHC014-MA15 (figure 1f). Alors que les poumons des souris infectées par le SRAS-MA15 présentaient une coloration robuste à la fois dans les bronchioles terminales et dans le parenchyme pulmonaire 2 d.p.i. (Fig. 1g), celles des souris infectées par SHC014-MA15 ont montré une diminution de la coloration de l'antigène des voies respiratoires (Fig. 1h); en revanche, aucun déficit dans la coloration de l'antigène n'a été observé dans le parenchyme ou dans le score histologique global, suggérant une infection différentielle du tissu pulmonaire pour SHC014-MA15 (tableau supplémentaire 2). Nous avons ensuite analysé l'infection chez des animaux âgés (12 mois) plus sensibles. Les animaux infectés par le SRAS-MA15 ont rapidement perdu du poids et succombé à l'infection (figure supplémentaire 3a, b). L'infection à SHC014-MA15 a induit une perte de poids robuste et soutenue, mais avait une létalité minimale. Les tendances de l'histologie et des profils de coloration de l'antigène que nous avons observées chez les jeunes souris ont été conservées chez les animaux plus âgés (tableau supplémentaire 3). Nous avons exclu la possibilité que SHC014-MA15 soit médiatrice de l'infection par un récepteur alternatif sur la base d'expériences utilisant des souris Ace2 - / -, qui n'ont pas montré de perte de poids ou de coloration d'antigène après une infection par SHC014-MA15 (Fig. 4a, b et Supplémentaire supplémentaires). Tableau 2). Ensemble, les données indiquent que les virus avec le pic SHC014 sont capables d'induire une perte de poids chez la souris dans le contexte d'un squelette CoV virulent.
Compte tenu de l'efficacité préclinique des thérapies par anticorps monoclonaux contre Ebola, telles que ZMApp10, nous avons ensuite cherché à déterminer l'efficacité des anticorps monoclonaux contre le SRAS-CoV contre l'infection par SHC014-MA15.
Quatre anticorps monoclonaux humains largement neutralisants ciblant la protéine de pointe du SRAS-CoV avaient déjà été signalés et sont des réactifs probables pour l'immunothérapie11,12,13. Nous avons examiné l'effet de ces anticorps sur la réplication virale (exprimé en pourcentage d'inhibition de la réplication virale) et avons constaté que, alors que le SARS-CoV Urbani de type sauvage était fortement neutralisé par les quatre anticorps à des concentrations d'anticorps relativement faibles (Fig.2a-d), la neutralisation variait pour SHC014-MA15. Fm6, un anticorps généré par l'affichage des phages et les mutants d'échappement 11,12, n'a atteint que des niveaux de fond d'inhibition de la réplication SHC014-MA15 (figure 2a). De même, les anticorps 230.15 et 227.14, qui étaient dérivés de cellules mémoire B de patients infectés par le SRAS-CoV13, n'ont pas non plus bloqué la réplication de SHC014-MA15 (Fig. 2b, c). Pour les trois anticorps, les différences entre les séquences d'acides aminés des pics SARS et SHC014 correspondaient à des changements de résidus directs ou adjacents trouvés dans les mutants d'échappement SARS-CoV (fm6 N479R; 230.15 L443V; 227.14 K390Q / E), ce qui explique probablement l'absence des anticorps 'activité neutralisante contre SHC014. Enfin, l'anticorps monoclonal 109.8 a pu atteindre une neutralisation à 50% de SHC014-MA15, mais uniquement à des concentrations élevées (10 μg / ml) (Fig. 2d). Ensemble, les résultats démontrent que les anticorps neutralisants à grande échelle contre le SRAS-CoV ne peuvent avoir qu'une efficacité marginale contre les souches émergentes de CoV de type SRAS telles que SHC014.
Figure 2: Les anticorps monoclonaux contre le SRAS-CoV ont une efficacité marginale contre les CoV de type SRAS.
figure2
 (a–d) Essais de neutralisation évaluant l'efficacité (mesurée en tant que réduction du nombre de plaques) d'un panel d'anticorps monoclonaux, qui ont tous été initialement générés contre le SRAS-CoV épidémique, contre l'infection des cellules Vero par le SARS-CoV Urbani (noir) ou SHC014-MA15 (vert). Les anticorps testés étaient fm6 (n = 3 pour Urbani; n = 5 pour SHC014-MA15) 11,12 (a), 230,15 (n = 3 pour Urbani; n = 2 pour SHC014-MA15) (b), 227,15 (n = 3 pour Urbani; n = 5 pour SHC014-MA15) (c) et 109,8 (n = 3 pour Urbani; n = 2 pour SHC014-MA15) 13 (d). Chaque point de données représente la moyenne du groupe et les barres d'erreur définissent la valeur s.e.m. Notez que les barres d'erreur dans les cellules Vero infectées par le SRAS-CoV Urbani en b, c sont superposées par les symboles et ne sont pas visibles.
Pour évaluer l'efficacité des vaccins existants contre l'infection par SHC014-MA15, nous avons vacciné des souris âgées avec du SARS-CoV (DIV) entier double-inactivé. Des travaux antérieurs ont montré que DIV pouvait neutraliser et protéger les jeunes souris contre la provocation par un virus homologue14; cependant, le vaccin n'a pas réussi à protéger les animaux âgés chez lesquels une pathologie immunitaire augmentée a également été observée, indiquant la possibilité que les animaux soient blessés en raison de la vaccination15. Ici, nous avons constaté que DIV n'a pas fourni de protection contre la provocation avec SHC014-MA15 en ce qui concerne la perte de poids ou le titre viral (Fig. Supplémentaire 5a, b). Conformément à un rapport précédent avec d'autres CoVs15 hétérologues du groupe 2b, le sérum de souris âgées vaccinées par DIV n'a pas non plus neutralisé SHC014-MA15 (figure supplémentaire 5c). Notamment, la vaccination DIV a entraîné une pathologie immunitaire robuste (tableau supplémentaire 4) et une éosinophilie (figure supplémentaire 5d – f). Ensemble, ces résultats confirment que le vaccin DIV ne protégerait pas contre l'infection par SHC014 et pourrait éventuellement augmenter la maladie dans le groupe vacciné âgé.
Contrairement à la vaccination des souris avec DIV, l'utilisation de SHC014-MA15 comme vaccin vivant atténué a montré une protection croisée potentielle contre la provocation par le SRAS-CoV, mais les résultats comportent d'importantes réserves. Nous avons infecté de jeunes souris avec 104 p.f.u. de SHC014-MA15 et les a observés pendant 28 jours. Nous avons ensuite provoqué les souris avec SARS-MA15 au jour 29 (Fig. Supplémentaire 6a). L'infection antérieure des souris par la dose élevée de SHC014-MA15 a conféré une protection contre la provocation par une dose létale de SRAS-MA15, bien qu'il n'y ait eu qu'une réponse de neutralisation minimale du SRAS-CoV des antisérums déclenchée 28 jours après l'infection par SHC014-MA15 ( Fig.6b supplémentaire, 1: 200). En l'absence de rappel d'antigène secondaire, 28 d.p.i. représente le pic attendu des titres d'anticorps et implique que la protection contre le SRAS-CoV diminuera avec le temps16,17. Des résultats similaires montrant une protection contre la provocation avec une dose létale de SARS-CoV ont été observés chez des souris BALB / c âgées en ce qui concerne la perte de poids et la réplication virale (figure supplémentaire 6c, d). Cependant, la dose d'infection SHC014-MA15 de 104 p.f.u. induit> 10% de perte de poids et de létalité chez certains animaux âgés (Fig. 1 et Fig. 3 supplémentaire). Nous avons constaté que la vaccination avec une dose plus faible de SHC014-MA15 (100 p.f.u.), n'induisait pas de perte de poids, mais elle ne protégeait pas non plus les animaux âgés d'une provocation par la dose létale du SRAS-MA15 (figure supplémentaire 6e, f). Ensemble, les données suggèrent que la provocation par SHC014-MA15 peut conférer une protection croisée contre le SRAS-CoV par le biais d'épitopes conservés, mais la dose requise induit la pathogenèse et empêche l'utilisation comme vaccin atténué.
Après avoir établi que la pointe SHC014 a la capacité de médier l'infection des cellules humaines et de provoquer des maladies chez la souris, nous avons ensuite synthétisé un clone infectieux SHC014-CoV de pleine longueur basé sur l'approche utilisée pour le SRAS-CoV (Fig.3a) 2. La réplication dans les cellules Vero n'a révélé aucun déficit pour SHC014-CoV par rapport à celui pour SARS-CoV (Fig. 3b); cependant, SHC014-CoV était significativement (P <0 24="" 3c="" 3d="" 48="" a="" adaptation="" apr="" att="" au="" aucune="" celle="" cellules="" cessaire="" chez="" compl="" cultures="" d="" dans="" de="" du="" duite="" e="" ensemble="" est="" et="" fois="" h="" humaines="" ig.="" in="" infection="" l="" la="" les="" longueur="" mais="" mentaire="" mique="" montr="" n="" nu="" par="" perte="" pid="" pleine="" plication="" poids="" poumons="" pour="" primaires="" qu="" que="" quivalente="" r="" rapport="" rent="" respiratoires="" s="" sa="" sars-cov="" shc014-cov="" significative="" soit="" souris.="" souris="" span="" sugg="" sultats="" suppl="" tablissent="" te="" une="" urbani="" viabilit="" virale="" vivo="">
Figure 3: SHC014-CoV pleine longueur se réplique dans les voies respiratoires humaines mais n'a pas la virulence du SRV-CoV épidémique.
figure3
(a) Schéma du clone moléculaire SHC014-CoV, qui a été synthétisé sous la forme de six ADNc contigus (désignés SHC014A, SHC014B, SHC014C, SHC014D, SHC014E et SHC014F) flanqués de sites BglI uniques qui ont permis l'assemblage dirigé de l'ADNc pleine longueur exprimant cadres de lecture ouverts (pour 1a, 1b, spike, 3, enveloppe, matrice, 6–8 et nucléocapside). Les nucléotides soulignés représentent les séquences en surplomb formées après le clivage de l'enzyme de restriction. (b, c) Réplication virale de SARS-CoV Urbani (noir) ou SHC014-CoV (vert) après infection de cellules Vero (b) ou cultures de cellules HAE à interface air-liquide primaire bien différenciées (c) à un MOI de 0,01. Des échantillons ont été prélevés à des moments individuels avec des répliques biologiques (n = 3) pour chaque groupe. Les données représentent une expérience pour les cellules Vero et HAE. (d, e) Perte de poids (n = 3 pour SARS-CoV MA15, n = 7 pour SHC014-CoV; n = 6 pour SARS-Urbani) (d) et réplication virale dans les poumons (n ​​= 3 pour SARS-Urbani et SHC014-CoV) (e) de souris BALB / c âgées de 10 semaines infectées par 1 × 105 pfu de SARS-CoV MA15 (gris), SHC014-CoV (vert) ou SARS-CoV Urbani (noir) via le i.n. route. Chaque point de données représente la moyenne du groupe et des barres d'erreur définissent la valeur s.e.m. ** P <0 bilat="" de="" en="" et="" individuels.="" le="" p="" points="" ral="" span="" student="" t="" temporels="" test="" utilisant="">
Pendant l'épidémie de SRAS-CoV, des liens ont été rapidement établis entre les civettes de palmier et les souches de CoV détectées chez l'homme4. S'appuyant sur cette découverte, le paradigme d'émergence commun soutient que le SRAS-CoV épidémique est originaire d'un virus de chauve-souris, a sauté aux civettes et a incorporé des changements dans le domaine de liaison aux récepteurs (RBD) pour améliorer la liaison à la civette Ace2 (réf. 18). Une exposition subséquente à des personnes sur les marchés d'animaux vivants a permis à l'infection humaine de la souche civette, qui, à son tour, s'est adaptée pour devenir la souche épidémique (Fig. 4a). Cependant, l'analyse phylogénétique suggère que les premières souches humaines du SRAS semblent plus étroitement liées aux souches de chauves-souris qu'aux souches de civette18. Par conséquent, un deuxième paradigme soutient que la transmission directe chauve-souris humaine a déclenché l'émergence du SRAS-CoV et que les civettes de palmier ont servi d'hôte secondaire et de réservoir pour une infection continue (Fig. 4b)19. Pour les deux paradigmes, l'adaptation des pointes chez un hôte secondaire est considérée comme une nécessité, la plupart des mutations devant se produire dans le RBD, facilitant ainsi une infection améliorée. Les deux théories impliquent que les pools de CoV des chauves-souris sont limités et que les mutations de la gamme d'hôtes sont à la fois aléatoires et rares, ce qui réduit la probabilité de futurs événements d'émergence chez l'homme.
Figure 4: Paradigmes d'émergence pour les coronavirus.
 figure4
Les souches de coronavirus sont maintenues dans des pools de quasi-espèces circulant dans les populations de chauves-souris. (a, b) Les théories traditionnelles sur l'émergence du SRAS-CoV supposent que les mutants de la gamme d'hôtes (cercle rouge) représentent des occurrences aléatoires et rares qui permettent l'infection d'hôtes alternatifs. Le paradigme de l'hôte secondaire (a) soutient qu'un hôte non humain est infecté par un virus progéniteur de chauve-souris et, par l'adaptation, facilite la transmission à l'homme; la réplication ultérieure chez l'homme conduit à la souche virale épidémique. Le paradigme direct (b) suggère que la transmission se produit entre les chauves-souris et les humains sans avoir besoin d'un hôte intermédiaire; la sélection se produit alors dans la population humaine avec des virus étroitement apparentés se répliquant dans un hôte secondaire, permettant une persistance et une adaptation virales continues dans les deux. (c) Les données des virus chimériques de type SRAS font valoir que les pools de quasi-espèces maintiennent plusieurs virus capables d'infecter les cellules humaines sans avoir besoin de mutations (cercles rouges). Bien que des adaptations chez des hôtes secondaires ou humains puissent être nécessaires pour l'émergence d'une épidémie, si des virus contenant des pointes SHC014 sont recombinés avec des squelettes CoV virulents (cercles avec des contours verts), alors la maladie épidémique peut être le résultat chez l'homme. Les données existantes prennent en charge les éléments des trois paradigmes.
Bien que notre étude n'invalide pas les autres voies d'émergence, elle plaide pour un troisième paradigme dans lequel les pools de CoV de chauves-souris en circulation maintiennent des protéines de pointe `` en équilibre '' qui sont capables d'infecter les humains sans mutation ni adaptation (Fig. 4c). Cette hypothèse est illustrée par la capacité d'un virus chimérique contenant la pointe SHC014 dans un squelette SARS-CoV à provoquer une infection robuste dans les cultures des voies respiratoires humaines et chez les souris sans adaptation RBD. Couplés à l'observation de squelettes CoV pathogènes précédemment identifiés3,20, nos résultats suggèrent que les matériaux de départ requis pour les souches émergentes de type SRAS circulent actuellement dans des réservoirs d'animaux. Notamment, bien que SHC014-CoV de pleine longueur nécessite probablement une adaptation supplémentaire du squelette pour médier la maladie humaine, les événements de recombinaison à haute fréquence documentés dans les familles de CoV soulignent la possibilité d'émergence future et la nécessité d'une préparation supplémentaire.
À ce jour, les dépistages génomiques des populations animales ont été principalement utilisés pour identifier de nouveaux virus dans les foyers21. L'approche ici étend ces ensembles de données pour examiner les questions d'émergence virale et d'efficacité thérapeutique. Nous considérons les virus avec le pic SHC014 comme une menace potentielle en raison de leur capacité à se répliquer dans les cultures des voies respiratoires humaines primaires, le meilleur modèle disponible pour les maladies humaines. De plus, la pathogenèse observée chez la souris indique une capacité des virus contenant SHC014 à provoquer des maladies dans les modèles mammifères, sans adaptation RBD. Notamment, le tropisme différentiel dans le poumon par rapport à celui avec le SRAS-MA15 et l'atténuation du SHC014-CoV de pleine longueur dans les cultures d'AOH par rapport au SARS-CoV Urbani suggèrent que des facteurs au-delà de la liaison ACE2, y compris la processivité des pointes, la biodisponibilité des récepteurs ou l'antagonisme des réponses immunitaires de l'hôte - peut contribuer à l'émergence. Cependant, des tests supplémentaires sur des primates non humains sont nécessaires pour traduire ces résultats en potentiel pathogène chez l'homme. Surtout, l'échec des thérapies disponibles définit un besoin critique pour une étude plus approfondie et pour le développement de traitements. Grâce à ces connaissances, des programmes de surveillance, des réactifs de diagnostic et des traitements efficaces peuvent être produits qui protègent contre l'émergence de CoV spécifiques au groupe 2b, tels que SHC014, et ceux-ci peuvent être appliqués à d'autres branches de CoV qui maintiennent des pools hétérogènes similaires.
En plus d'offrir une préparation contre les futurs virus émergents, cette approche doit être envisagée dans le contexte de la pause imposée par le gouvernement américain sur les études de gain de fonction (GOF)22. Sur la base des modèles d'émergence précédents (Fig. 4a,b), la création de virus chimériques tels que SHC014-MA15 ne devrait pas augmenter la pathogénicité. Bien que SHC014-MA15 soit atténué par rapport à son SARS-CoV adapté à la souris parentale, des études similaires examinant la pathogénicité des CoV avec la pointe Urbani de type sauvage dans le squelette MA15 n'ont montré aucune perte de poids chez la souris et une réplication virale réduite23. Ainsi, par rapport au pic Urbani-MA15 CoV, SHC014-MA15 montre un gain de pathogenèse (Fig. 1). Sur la base de ces résultats, les comités d'examen scientifique peuvent juger les études similaires construisant des virus chimériques basés sur des souches en circulation trop risquées, car une pathogénicité accrue dans les modèles mammifères ne peut être exclue. Couplé à des restrictions sur les souches adaptées à la souris et au développement d'anticorps monoclonaux utilisant des mutants d'échappement, la recherche sur l'émergence de CoV et l'efficacité thérapeutique pourrait être sérieusement limitée à l'avenir. Ensemble, ces données et restrictions représentent un carrefour des préoccupations de recherche du GOF; le potentiel de préparation et d'atténuation des flambées futures doit être mis en balance avec le risque de création d'agents pathogènes plus dangereux. Lors de l'élaboration de politiques à l'avenir, il est important de tenir compte de la valeur des données générées par ces études et de savoir si ces types d'études sur le virus chimérique justifient une enquête plus approfondie par rapport aux risques inhérents impliqués.
Dans l'ensemble, notre approche a utilisé des données de métagénomique pour identifier une menace potentielle posée par la chauve-souris circulante de type SRV CoC SHC014. En raison de la capacité des virus chimériques SHC014 à se répliquer dans les cultures des voies respiratoires humaines, à provoquer une pathogenèse in vivo et à échapper aux thérapies actuelles, il existe un besoin à la fois de surveillance et de thérapies améliorées contre les virus de type SRAS en circulation. Notre approche permet également de débloquer l'utilisation des données métagénomiques pour prédire l'émergence virale et d'appliquer ces connaissances dans la préparation du traitement des futures infections virales émergentes.
Les méthodes
Virus, cellules, infection in vitro et tests sur plaque.
Le SARS-CoV de type sauvage (Urbani), le SARS-CoV adapté aux souris (MA15) et les CoV chimériques de type SARS ont été cultivés sur des cellules Vero E6 (obtenues auprès de l'Institut de recherche médicale des États-Unis sur les maladies infectieuses), cultivées dans le Eagle's modifié de Dulbecco. moyen (DMEM) (Gibco, CA) et 5% de sérum de clone fœtal (FCS) (Hyclone, South Logan, UT) avec un antibiotique / antimycotique (Gibco, Carlsbad, CA). Des cellules DBT (laboratoire barique, source inconnue) exprimant des orthologues ACE2 ont été précédemment décrites pour l'homme et la civette; la séquence bat Ace2 était basée sur celle de Rhinolophus leschenaulti, et les cellules DBT exprimant la batte Ace2 ont été établies comme décrit précédemment8. Les expériences de pseudotypage étaient similaires à celles utilisant un pseudovirus basé sur le VIH, préparées comme décrit précédemment10, et examinées sur des cellules HeLa (Wuhan Institute of Virology) qui exprimaient des orthologues ACE2. Les cellules HeLa ont été cultivées dans un milieu essentiel minimal (MEM) (Gibco, CA) additionné de 10% de FCS (Gibco, CA) comme décrit précédemment24. Les courbes de croissance dans Vero E6, DBT, Calu-3 2B4 et les cellules épithéliales des voies aériennes humaines primaires ont été réalisées comme décrit précédemment8,25. Aucun des stocks de lignées cellulaires de travail n'a été authentifié ou testé pour les mycoplasmes récemment, bien que les stocks de semences d'origine utilisés pour créer les stocks de travail soient exempts de contamination. Les poumons humains pour les cultures d'AOH ont été acquis en vertu des protocoles approuvés par le Chapel Hill Institutional Review Board de l'Université de Caroline du Nord. Les cultures d'AOH représentent un épithélium des voies respiratoires humaines hautement différencié contenant des cellules épithéliales ciliées et non ciliées ainsi que des cellules caliciformes. Les cultures sont également cultivées sur une interface air-liquide pendant plusieurs semaines avant utilisation, comme décrit précédemment26. En bref, les cellules ont été lavées avec du PBS et inoculées avec du virus ou simulées diluées dans du PBS pendant 40 min à 37 ° C. Après l'inoculation, les cellules ont été lavées trois fois et du milieu frais a été ajouté pour indiquer le temps «0». Trois réplicats biologiques ou plus ont été récoltés à chaque moment décrit. Aucun aveuglement n'a été utilisé dans les collections d'échantillons ni les échantillons ont été randomisés. Toute la culture du virus a été réalisée dans un laboratoire de niveau de biosécurité (BSL) 3 avec des ventilateurs redondants dans les armoires de biosécurité, comme décrit précédemment par notre groupe2. Tout le personnel portait des respirateurs à adduction d'air filtré (Breathe Easy, 3M) avec des combinaisons, des tabliers et des bottillons Tyvek et portait un double gant.
Regroupement de séquences et modélisation structurelle.
Les séquences génomiques complètes et les séquences d'acides aminés des domaines S1 du pic de CoV représentatifs ont été téléchargées à partir de Genbank ou Pathosystems Resource Integration Center (PATRIC), alignées avec ClustalX et comparées phylogénétiquement en utilisant l'estimation de la probabilité maximale à l'aide de 100 bootstrap ou en en utilisant respectivement le package PhyML (https://code.google.com/p/phyml/) L'arbre a été généré en utilisant le maximum de vraisemblance avec le package PhyML. La barre d'échelle représente les substitutions de nucléotides. Seuls les nœuds avec un support d'amorçage supérieur à 70% sont étiquetés. L'arbre montre que les CoV sont divisés en trois groupes phylogénétiques distincts définis comme α-CoV, β-CoV et γ-CoV. Les grappes de sous-groupes classiques sont marquées 2a, 2b, 2c et 2d pour les β-CoV et 1a et 1b pour les α-CoV. Des modèles structurels ont été générés à l'aide de Modeller (Max Planck Institute Bioinformatics Toolkit) pour générer des modèles d'homologie pour SHC014 et Rs3367 du SARS RBD en complexe avec ACE2 sur la base de la structure cristalline 2AJF (Protein Data Bank). Les modèles d'homologie ont été visualisés et manipulés dans MacPyMol (version 1.3).
Construction de virus chimériques de type SRAS.
Les virus de type sauvage et chimérique sont tous deux dérivés du SARS-CoV Urbani ou du clone infectieux (ic) adapté à la souris (SARS-CoV MA15) comme décrit précédemment27. Les plasmides contenant des séquences de pointes pour SHC014 ont été extraits par digestion de restriction et ligaturés dans les plasmides E et F du clone infectieux MA15. Le clone a été conçu et acheté auprès de Bio Basic sous la forme de six ADNc contigus en utilisant des séquences publiées flanquées de sites d'endonucléases de restriction de classe II uniques (Bgll). Par la suite, des plasmides contenant des fragments de génome de type sauvage, SARS-CoV et SHC014-CoV de type sauvage ont été amplifiés, excisés, ligaturés et purifiés. Les réactions de transcription in vitro ont ensuite été préformées pour synthétiser l'ARN génomique complet, qui a été transfecté dans les cellules Vero E6 comme décrit précédemment2. Le milieu des cellules transfectées a été récolté et a servi de stock de semences pour les expériences ultérieures. Les virus chimériques et de pleine longueur ont été confirmés par analyse de séquence avant utilisation dans ces études. La construction synthétique du mutant chimérique et du SHC014-CoV pleine longueur a été approuvée par le comité de biosécurité institutionnelle de l'Université de Caroline du Nord et le comité de recherche préoccupante à double usage.
Déclaration d'éthique.
Cette étude a été réalisée conformément aux recommandations pour le soin et l'utilisation des animaux par l'Office of Laboratory Animal Welfare (OLAW), NIH. Le Comité institutionnel de protection et d'utilisation des animaux (IACUC) de l'Université de Caroline du Nord à Chapel Hill (UNC, numéro de permis A-3410-01) a approuvé le protocole d'étude sur les animaux (IACUC # 13-033) utilisé dans ces études.
Souris et infection in vivo.
Des souris BALB / cAnNHsD âgées de 10 semaines et de 12 mois ont été commandées auprès des Laboratoires Harlan. Les infections de souris ont été effectuées comme décrit précédemment20. En bref, les animaux ont été amenés dans un laboratoire BSL3 et autorisés à s'acclimater pendant 1 semaine avant l'infection. Pour l'infection et la vaccination contre le virus vivant atténué, les souris ont été anesthésiées avec un mélange de kétamine et de xylazine et infectées par voie intranasale, en cas de provocation, avec 50 μl de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) ou virus dilué avec trois ou quatre souris par point dans le temps, par groupe d'infection par dose comme décrit dans les légendes des figures. Pour les souris individuelles, les notations d'infection, notamment le fait de ne pas inhaler la totalité de la dose, le bouillonnement de l'inoculum par le nez ou l'infection par la bouche, peuvent avoir conduit à l'exclusion des données de la souris à la discrétion du chercheur; post-infection, aucun autre critère d'exclusion ou d'inclusion préétabli n'est défini. Aucun aveuglement n'a été utilisé dans les expériences animales et les animaux n'ont pas été randomisés. Pour la vaccination, les souris jeunes et âgées ont été vaccinées par injection de coussinets plantaires avec un volume de 20 μl de 0,2 μg de vaccin SARS-CoV double-inactivé avec de l'alun ou du faux PBS; les souris ont ensuite été boostées avec le même régime 22 jours plus tard et provoquées 21 jours par la suite. Pour tous les groupes, selon le protocole, les animaux ont été surveillés quotidiennement pour les signes cliniques de la maladie (courbure, fourrure ébouriffée et activité réduite) pendant la durée de l'expérience. La perte de poids a été surveillée quotidiennement pendant les 7 premiers jours, après quoi la surveillance du poids s'est poursuivie jusqu'à ce que les animaux retrouvent leur poids de départ initial ou affichent une prise de poids continue pendant 3 jours. Toutes les souris qui ont perdu plus de 20% de leur poids corporel de départ ont été nourries au sol et surveillées plusieurs fois par jour tant qu'elles étaient sous la limite de 20%. Les souris qui ont perdu plus de 30% de leur poids corporel de départ ont été immédiatement sacrifiées selon le protocole. Toute souris jugée moribonde ou peu susceptible de récupérer a également été sacrifiée sans cruauté à la discrétion du chercheur. L'euthanasie a été réalisée à l'aide d'une surdose d'isoflurane et la mort a été confirmée par luxation cervicale. Toutes les études sur les souris ont été réalisées à l'Université de Caroline du Nord (assurance du bien-être animal # A3410-01) en utilisant des protocoles approuvés par le Comité UNC Institutional Animal Care and Use (IACUC).
Analyse histologique.
Le poumon gauche a été retiré et immergé dans du formol tamponné à 10% (Fisher) sans gonflement pendant 1 semaine. Les tissus ont été inclus dans de la paraffine et des coupes de 5 μm ont été préparées par le centre d'histopathologie UNC Lineberger Comprehensive Cancer Center. Pour déterminer l'étendue de la coloration de l'antigène, des coupes ont été colorées pour l'antigène viral en utilisant un anticorps anti-nucléocapside polyclonal SARS-CoV disponible dans le commerce (Imgenex) et notées de manière aveugle par pour la coloration des voies respiratoires et du parenchyme comme décrit précédemment20. Les images ont été capturées à l'aide d'un microscope Olympus BX41 avec une caméra Olympus DP71.
Essais de neutralisation de virus.
Des tests de titre de neutralisation de la réduction de la plaque ont été réalisés avec des anticorps précédemment caractérisés contre le SRAS-CoV, comme décrit précédemment11,12,13. En bref, les anticorps neutralisants ou le sérum ont été dilués en série en deux et incubés avec 100 p.f.u. des différentes souches infectieuses du clone SARS-CoV pendant 1 h à 37 ° C. Le virus et les anticorps ont ensuite été ajoutés à une plaque à 6 puits avec 5 × 105 cellules Vero E6 / puits avec plusieurs répétitions (n ​​≥ 2). Après une incubation d'une heure à 37 ° C, les cellules ont été recouvertes de 3 ml d'agarose à 0,8% dans le milieu. Les plaques ont été incubées pendant 2 jours à 37 ° C, colorées au rouge neutre pendant 3 h et les plaques ont été comptées. Le pourcentage de réduction de la plaque a été calculé comme (1 - (nombre de plaques avec anticorps / nombre de plaques sans anticorps)) × 100.
Analyse statistique.
Toutes les expériences ont été menées en contrastant deux groupes expérimentaux (soit deux virus, soit des cohortes vaccinées et non vaccinées). Par conséquent, des différences significatives dans le titre viral et la notation histologique ont été déterminées par un test t de Student bilatéral à des moments individuels. Les données étaient normalement distribuées dans chaque groupe comparé et présentaient une variance similaire.
Biosécurité.
Les études signalées ont été lancées après l'approbation du protocole expérimental par le Comité institutionnel de biosécurité de l'Université de Caroline du Nord (Titre du projet: Génération de clones infectieux de CoV de type SARS de chauve-souris; ID de plan de sécurité de laboratoire: 20145741; annexe G ID: 12279). Ces études ont été lancées avant la pause du financement de la recherche sur le processus délibératif du gouvernement américain sur certaines recherches sur le gain de fonction impliquant les virus de la grippe, du MERS et du SRAS (http://www.phe.gov/s3/dualuse/Documents/gain-of-function.pdf)
Ce document a été examiné par l'agence de financement, le NIH. La poursuite de ces études a été demandée, ce qui a été approuvé par le NIH.
SARS-CoV est un agent sélectif. Tout le travail pour ces études a été effectué avec des procédures opératoires normalisées (SOP) et des conditions de sécurité approuvées pour le SRAS-CoV, le MERs-CoV et d'autres CoV associés.
Nos installations institutionnelles CoV BSL3 ont été conçues pour se conformer aux exigences de sécurité recommandées par les laboratoires de biosécurité dans les laboratoires microbiologiques et biomédicaux (BMBL), le département américain de la Santé et des Services sociaux, le service de santé publique, les Centers for Disease Control (CDC). ) et le NIH. Des plans de sécurité en laboratoire ont été soumis au Département de la santé et de la sécurité environnementale (EHS) et du CDC, et l'installation a été approuvée. Un accès par carte électronique est requis pour entrer dans l'établissement. Tous les travailleurs ont été formés par EHS à utiliser en toute sécurité des respirateurs à adduction d'air filtré (PAPR), et des habitudes de travail appropriées dans un établissement BSL3 et des plans de surveillance médicale active sont en place. Nos installations CoV BSL3 contiennent des ventilateurs redondants, l'alimentation de secours des ventilateurs et des armoires de sécurité biologique et des congélateurs, et nos installations peuvent accueillir des racks de souris SealSafe. Les matières classées comme agents BSL3 sont constituées de souches de précurseurs du SRAS-CoV, de bat CoV, de MERS-CoV et de mutants dérivés de ces agents pathogènes. Dans les installations BSL3, l'expérimentation de virus infectieux est effectuée dans une armoire de biosécurité certifiée de classe II (BSC). Tous les membres du personnel portent des gommages, des costumes et des tabliers Tyvek, des PAPR et des couvre-chaussures, et leurs mains sont à double gant. Les utilisateurs de BSL3 sont soumis à un plan de surveillance médicale surveillé par la Clinique de santé au travail des employés de l'Université (UEOHC), qui comprend une vaccination annuelle contre la grippe physique et annuelle et la déclaration obligatoire de tout symptôme associé à l'infection à CoV pendant les périodes de travail dans le BSL3. Tous les utilisateurs de BSL3 sont formés à la gestion de l'exposition et aux protocoles de déclaration, sont prêts à s'auto-mettre en quarantaine et ont été formés pour une livraison en toute sécurité à un service local de gestion des maladies infectieuses en cas d'urgence. Tous les événements d'exposition potentiels sont signalés et examinés par l'EHS et l'UEOHC, avec des rapports déposés à la fois au CDC et au NIH.

Source : COVID 19, Created in North Carolina for Bio-Warfare, Paid for by the CIA and Trump Blames China par Veterans Today

Traduction automatique
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NOTES de H. G.
Hannibal GENSÉRIC

2 commentaires:

  1. des preuves que les usa sont des criminels ...vietnam,Cambodge, laos , Lybie, Irak, kossovo, Ukraine Syrie, liban, palestine etc..etc....

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  2. Vraiment le gouvernement américain est sans morale et sans coeur

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